人牙周膜干細(xì)胞衰老過程中表觀遺傳學(xué)酶的篩選及其功能研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）具有較強(qiáng)自我更新能力和多向分化潛能，并且能夠在特殊條件誘導(dǎo)下，分化形成包括骨組織、軟骨組織和脂肪組織在內(nèi)的多種類型的組織。目前已經(jīng)在多種組織和器官中發(fā)現(xiàn)了MSC。在組織再生過程中，由于MSC具有較強(qiáng)增殖和分化能力，因此在組織工程領(lǐng)域中，MSC可作為種子細(xì)胞參與組織的再生和重建。然而，臨床前期的體外研究卻發(fā)現(xiàn)諸多問題，包括其來源問題、定向分化問題、自身或體外擴(kuò)增后的衰老問

2、題，這些均有可能影響其在體內(nèi)的治療效果，尤其是自身或體外擴(kuò)增后的衰老，因?yàn)樵谒ダ系倪^程中，MSC的生物學(xué)行為都可能出現(xiàn)不同程度的弱化現(xiàn)象，從而影響體內(nèi)的治療效果。衰老是指機(jī)體的細(xì)胞、組織和器官在功能上出現(xiàn)的逐步弱化的生理過程，主要表現(xiàn)為自身抵抗能力的降低以及對外界環(huán)境刺激反應(yīng)能力的降低，從而誘發(fā)疾病的易感性并最終引起死亡。在機(jī)體衰老的過程中，由于受到病理、環(huán)境等因素的刺激，MSC的自我調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生異常改變，從而使其某些生物學(xué)性狀不再穩(wěn)定

3、。
　　衰老是機(jī)體的細(xì)胞、組織和器官在功能上出現(xiàn)的逐步弱化的生理過程，主要表現(xiàn)為自身抵抗能力的降低以及對外界環(huán)境刺激反應(yīng)能力的降低，從而誘發(fā)疾病的易感性并最終引起死亡。衰老是一種復(fù)雜的生命過程，是多種因素參與并發(fā)揮作用的，如信號通路中某個(gè)因子的基因突變、環(huán)境因素的改變、染色體和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的異常調(diào)節(jié)作用。在這一過程中，多種因素的刺激作用往往能夠引起染色體異常調(diào)節(jié)。研究表明：與其他的單純性因素相比較，這種染色體異常調(diào)節(jié)所引起的基因表

4、達(dá)異常在體內(nèi)的持續(xù)狀態(tài)更加持久，并且可以穩(wěn)定遺傳。因此，表觀遺傳學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。表觀遺傳學(xué)（epigenetic）是與遺傳學(xué)(genetic)相對應(yīng)的概念。遺傳學(xué)是研究基于堿基對序列改變而引起的個(gè)體之間基因表達(dá)水平差異；而表觀遺傳學(xué)則是研究基于基因狀態(tài)改變而引起的基因表達(dá)水平差異。比較通俗的講，表觀遺傳學(xué)研究的是則是指：DN A堿基對序列在未發(fā)生改變的情況下，基因開放狀態(tài)發(fā)生異常改變、并且這種異常狀態(tài)可以穩(wěn)定遺傳，也包括生物生命活動(dòng)中多種程

5、序性的研究。因此，從這個(gè)意義上看，表觀遺傳學(xué)在生物體應(yīng)激、發(fā)育、衰老、生病等生命過程中都發(fā)揮了重要作用。
　　眾所周知，牙周炎是危害人類口腔健康的重要疾病，是導(dǎo)致成年人牙齒缺失的首要原因，傳統(tǒng)的牙周治療能夠有效控制/延緩疾病的進(jìn)一步發(fā)展，但都不能真正地實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的完全再生。隨著組織工程技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，利用干細(xì)胞促進(jìn)組織再生成為研究熱點(diǎn)。研究表明，利用牙周膜干細(xì)胞可以有效促進(jìn)牙周組織再生，其中2010年發(fā)表在Oral Di

6、seases上的世界首篇利用自體牙周膜來源的細(xì)胞治療牙周炎的臨床報(bào)道，該結(jié)果將牙周細(xì)胞治療的研究和臨床應(yīng)用推進(jìn)到一個(gè)從所未有的高度。值得注意的是，臨床上牙周炎患者大多為中老年人，而有研究報(bào)道，牙周膜干細(xì)胞會(huì)因年齡因素影響其生物學(xué)性能。有研究表明機(jī)體在衰老的過程中，由于受到病理、環(huán)境等因素的刺激，間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）的自我調(diào)節(jié)機(jī)制會(huì)發(fā)生異常改變，從而使其某些生物學(xué)性狀不再穩(wěn)定。因此，進(jìn)一步探

7、索機(jī)體在隨著年齡增長而衰老的過程中，表觀遺傳學(xué)是否參與了牙周炎的發(fā)展，是否影響了牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)性能的改變，有利于加速牙周膜干細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化。
　　目的：
　　通過篩選機(jī)體在衰老過程中，人牙周膜干細(xì)胞（human Periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）發(fā)生高通量變化的表觀遺傳學(xué)酶，并探索這些表觀遺傳學(xué)酶如何影響hPDLSCs的生物學(xué)性能，從而明確年齡因素影響hPDLSCs的生物學(xué)

8、性能的可能機(jī)制，為將來臨床應(yīng)用牙周膜干細(xì)胞提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)分組：將臨床上獲得的離體第三磨牙按18-35歲、36歲-55歲和56歲-62歲三個(gè)年齡階段劃分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。
　　2、hPDLSCs分離、培養(yǎng)和鑒定：利用改良組織塊法分離、培養(yǎng)原代hPDLSCs；通過有限稀釋法純化hPDLSCs。流式細(xì)胞術(shù)檢測相關(guān)干細(xì)胞表面標(biāo)記物；噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色

9、法、成纖維細(xì)胞集落形成單位（Colony forming unit-firbroblast，CFU-F）檢測細(xì)胞自我更新能力；條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)各實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs的成骨、成脂分化，并比較分化能力的差異。
　　3、hPDLSCs衰老過程中的表觀遺傳酶的篩選：利用RT-PCR技術(shù)篩查在各樣本中各實(shí)驗(yàn)組表觀遺傳學(xué)酶的表達(dá)差異；并利用Western-blot進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果；Western-blot檢測比較各實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs

10、中組蛋白H3乙?；讲町悺?br>　　4、Gcn5、p300對hPDLSCs成骨能力的影響：通過篩選結(jié)果確定目標(biāo)蛋白為Gcn5、p300；利用siRNA干擾hPDLSCs組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶Gcn5、p300的表達(dá)水平后，誘導(dǎo)hPDLSCs骨向分化；分別在長時(shí)間點(diǎn)（4周）和短時(shí)間點(diǎn)（7天），利用RT-PCR和western blot技術(shù)分析比較hPDLSCs在siRNA干擾前（對照組）和siRNA干擾后（實(shí)驗(yàn)組）成骨相關(guān)基因ALP、RU

11、NX2、OCN表達(dá)水平；同時(shí)在成骨四周后茜素紅染色定量分析實(shí)驗(yàn)組和對照組成骨能力差異。
　　5、Gcn5、p300對hPDLSCs增殖能力的影響：利用siRNA干擾年輕hPDLSCs組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶Gcn5、p300的表達(dá)水平后，MTT檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的增殖活性，細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期的分布情況；組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶p300特異性激活劑CTPB處理衰老細(xì)胞后，利用相同的方法分析實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞的增殖能力的差異。
　　6

12、、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）形式表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)p值取雙側(cè)0.05。
　　結(jié)果：
　　1、本實(shí)驗(yàn)利用改良組織塊法可成功獲得不同年齡階段hPDLSCs，鏡下觀察年輕組細(xì)胞體積小呈梭形，而隨年齡的增長細(xì)胞體積增大，各實(shí)驗(yàn)組均具有自我增殖能力和細(xì)胞克隆能力，但細(xì)胞的增殖能力明顯隨年齡的增加而減弱（p＜0.05）。流式細(xì)胞

13、檢測顯示：各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均能陽性表達(dá)間充質(zhì)來源干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD90和CD146；陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記CD31。骨向分化與脂向分化的結(jié)果顯示：hPDLSCs在衰老過程中其成骨能力明顯減弱（p＜0.05）；而其成脂能力與年齡因素不存在明確關(guān)系（p＞0.05）。β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：hPDLSCs在衰老組有較高的β-半乳糖苷酶染色陽性率（p＜0.05）。
　　2、本實(shí)驗(yàn)主要篩查參與組蛋白修飾的

14、各個(gè)家族的表觀遺傳學(xué)酶，篩查對象包括：組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙酰化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去甲基化酶。在多個(gè)修飾家族中，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶家族在衰老的過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的下調(diào)趨勢；其中，組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶家族的Gc n5和p300在各樣本中都發(fā)生高通量變化，且各實(shí)驗(yàn)組之間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。同時(shí)，Western-b lot結(jié)果顯示：組蛋白H3乙?；匠尸F(xiàn)下降趨勢。
　　3、轉(zhuǎn)染siRNA干擾Gcn5、

15、p300的表達(dá)后能夠明顯的抑制目的基因的表達(dá)水平。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的hPDLSCs成骨，比較成骨早期和晚期的相關(guān)成骨基因檢測發(fā)現(xiàn)：Gcn5、p300的表達(dá)水平明顯受到抑制，但RT-PCR和western檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組成骨相關(guān)基因表達(dá)水平并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。
　　4、轉(zhuǎn)染siRNA干擾Gcn5、p300表達(dá)后分析實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞周期與MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)：hPDLSCs的增殖能力減弱；相反的，用250μM的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶

16、p300激活劑CTPB處理衰老細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1、hP DLSCs的增殖能力和骨向分化能力隨年齡增加呈現(xiàn)下降趨勢，而脂向分化能力無明顯變化；β-gal活性隨年齡增加而增加。
　　2、在衰老的過程中，組蛋白乙?；匠氏陆档内厔荩⑶蚁鄳?yīng)參與此過程的酶的表達(dá)水平也隨之下降，其中組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶Gcn5、p300呈現(xiàn)高通量表達(dá)。
　　3、組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶Gcn5和p300對hPDLS