細胞復制性衰老及過氧化氫誘導早衰過程中表觀遺傳學調控.pdf

1、1研究背景: 細胞不斷經受內源性和外源性的各種應激和損傷，體外培養(yǎng)的人成纖維細胞具有一定的增殖能力，經過一系列傳代之后，逐漸變得衰老，即細胞復制性衰老。氧化應激可以導致DNA損傷或干擾異染色質，因而誘導早期傳代的細胞過早衰老，即應激誘導的細胞早衰。過氧化氫可短期內作用于細胞獲得氧化應激誘導的早衰。細胞復制性衰老與應激誘導的早衰具有相似的衰老表型，如細胞變大扁平，伴隨有核和核仁的體積增大，失去細胞與細胞間接觸，衰老相關β-半乳糖苷

2、酶表達等等，而兩者具體的內在調控機制可能存在差異。細胞衰老的機制可能是人類衰老及衰老相關性疾病的分子基礎。 延緩衰老及治療衰老相關性疾病是人類最大的夢想之一，目前對于衰老機制的認識仍很局限。近來研究表明，表觀遺傳學，也稱外遺傳學，是研究機體發(fā)育及細胞增殖過程中基因表達調控的改變，這些改變可受環(huán)境因素的影響，其修飾的改變可能是細胞衰老一個決定性因素。表觀遺傳學修飾包括DNA甲基化和組蛋白的轉錄后修飾，即組蛋白甲基化、乙?；土姿峄?/p>

3、修飾，ATP依賴的染色質結構重塑。然而，在表觀遺傳學和細胞及器官衰老方面的研究資料尚較匱乏，這可能跟衰老本身的復雜性有關。目前有限的資料表明，DNA甲基化可能修飾一些衰老相關調控基因，隨著年齡增加，這種修飾作用減弱或增強，確定這些改變是隨機的或“程序性”的，及是否受環(huán)境氧化應激的影響十分重要。組蛋白H3和H4N末端共價修飾可促進染色質重建，組蛋白修飾及其不同組合參與基因轉錄的活化或沉默。 衰老是內、外因素共同作用的結果，是一種多

4、基因的復合調控過程，但衰老的始動因素及其發(fā)生、發(fā)展機制仍有待探究。表觀遺傳學修飾可能提供了細胞衰老所需的表觀微環(huán)境，如果能通過此途徑揭示衰老的分子機制，且找到延緩衰老進程的方法，將具有重大的生物學意義和臨床應用前景。 本研究應用體外培養(yǎng)的人胚肺二倍體成纖維細胞為研究對象，檢測正常細胞復制性衰老及過氧化氫誘導的細胞早衰過程中表觀遺傳學調控的作用，包括全基因組DNA甲基化、整體的組蛋白乙?；凹谆兓槐碛^遺傳學相關酶的表達變化及

5、其活性改變；衰老相關基因mRNA水平表達變化及其轉錄調控區(qū)域DNA甲基化改變和組蛋白修飾狀況；并尋找正常年輕細胞及復制性衰老細胞基因組轉錄調控區(qū)域未知的差異甲基化基因，為細胞衰老過程中表觀遺傳學調控作用提供理論依據(jù)。 2材料與方法: 2.1建立細胞復制性衰老及過氧化氫誘導的細胞早衰模型建立體外培養(yǎng)的正常人胚肺成纖維細胞復制性衰老模型及400μM過氧化氫誘導的細胞早衰模型，觀察在細胞正常復制性衰老及早衰過程中，細胞的一般生

6、物學特性改變，包括細胞形態(tài)，生長曲線，壽命周期，細胞周期分布及衰老相關β-半乳糖苷酶表達的變化。 2.2檢測基因組DNA甲基化調控以5-甲基胞嘧啶抗體免疫熒光方法及[3H]甲基摻入法檢測人胚肺成纖維細胞基因組DNA整體甲基化變化趨勢；基于ELISA樣反應方法檢測甲基轉移酶總的活性改變；并以Q-PCR和WesternBlot方法檢測甲基轉移酶和甲基化結合蛋白mRNA和蛋白水平的表達變化，同時觀察了5-氮雜胞苷對各甲基轉移酶和甲基化

7、結合蛋白表達的影響。 2.3組蛋白整體乙酰化與甲基化調控以相應抗體的細胞免疫熒光方法觀察組蛋白H3，H4整體乙?；厔菁敖M蛋白H4(Lys20)整體甲基化趨勢的改變；基于ELISA樣反應方法檢測組蛋白總體去乙?；傅幕钚宰兓?；并以Q-PCR方法檢測乙?；傅膍RNA表達，以Q-PCR方法和WesternBlot方法檢測去乙酰化酶的mRNA和蛋白水平的表達，同時觀察曲古霉素A對乙?；负腿ヒ阴；副磉_的影響。 2.4檢測衰

8、老相關基因的表達及其啟動子區(qū)甲基化狀況以Q-PCR方法檢測P53，PI6，IGF2，P66，F(xiàn)OXA2的mRNA表達水平；在亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA的基礎上，以甲基化特異性PCR檢測上述基因啟動子區(qū)域的甲基化狀況；同時對年輕細胞，復制性衰老細胞及早衰細胞組的P66，F(xiàn)OXA2啟動子區(qū)域的CpG島進行克隆測序，全面觀察其CpG島甲基化修飾狀況。 2.5衰老相關基因轉錄調控區(qū)域的組蛋白乙酰化及甲基化修飾以染色質免疫沉淀結合定量PC

9、R的方法檢測年輕細胞，中年細胞，復制性衰老細胞及早衰細胞組P53，P16，IGF2，P66，F(xiàn)OXA2基因轉錄調控區(qū)域的組蛋白修飾情況，包括組蛋白H3，H4乙酰化修飾及組蛋白H3(Lys4)，H4(Lys20)的甲基化修飾狀況。 2.6檢測年輕細胞及復制性衰老細胞轉錄調控區(qū)域CpG島差異表達基因以甲基化的DNA免疫沉淀結合基因芯片技術檢測年輕細胞及復制性衰老細胞啟動子及第一外顯子區(qū)域CpG島差異表達的基因，并進行兩組細胞差異的甲

10、基化基因感興趣分類。 3結果: 3.1細胞復制性衰老與細胞早衰具有相同的形態(tài)學特征和增殖能力體外培養(yǎng)的正常人胚肺成纖維細胞于52PDL進入不可逆的復制性衰老狀態(tài)，依據(jù)細胞的群體倍增水平(PDL)，分為22PDL(年輕細胞組)，35PDL(中年細胞組)和49PDL(復制性衰老細胞組)。同步培養(yǎng)的22PDL人胚肺成纖維細胞，以400μMH2O2連續(xù)染毒4次，每天1次，每次2h，染毒后繼續(xù)培養(yǎng)7天，細胞呈現(xiàn)不可逆的早衰狀態(tài)，分

11、為早衰起始組和早衰持續(xù)組。復制性衰老及早衰細胞處于衰老狀態(tài)后均可維持存活1個月以上，細胞變大扁平，飽和度降低。復制性衰老模型中各組細胞群體倍增時間為22PDL48h，35PDL52h，49PDL96h。細胞早衰模型中，4次染毒期間，細胞均有不同程度的增殖，染毒4次后，細胞幾乎停止增殖，處于明顯的不可逆早衰狀態(tài)。復制性衰老的細胞壽命周期為110天，早衰的為50天。細胞周期分布中G1％分別為22PDL35.5％，35PDL72.6％和49P

12、DL89.5％及早衰起始組61.6％，早衰持續(xù)組77.2％：細胞增殖指數(shù)隨增齡呈現(xiàn)降低的變化趨勢。衰老相關β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率分別為22PDL5.1％，35PDL15.7％和49PDL90.7％及衰老起始組43.8％，衰老持續(xù)組91.3％。 3.2衰老的細胞呈現(xiàn)較低的基因組DNA甲基化水平，復制性衰老與早衰甲基化調控存在差異甲基化免疫熒光實驗結果顯示，細胞復制性衰老過程中，基因組DNA甲基化水平逐漸降低；染毒組細胞早衰過

13、程中，基因組DNA甲基化水平也逐漸降低；【3H]甲基摻入實驗得到一致的結果，甲基化的CpG％分別為22PDL68.2％，35PDL41.9％和49PDL16.1％及早衰起始組63.5％，早衰持續(xù)組18.0％。復制性衰老及早衰的細胞都呈現(xiàn)出明顯的低甲基化水平。 3.3衰老的細胞呈現(xiàn)整體組蛋白H3，H4低乙?；癏4K20高甲基化水平，復制性衰老與早衰組蛋白修飾調控存在差異細胞免疫熒光結果顯示，細胞衰老過程中，與年輕細胞相比，組蛋白

14、H3，H4整體乙?；厔葜饾u降低，早衰起始組略低于中年細胞組，早衰持續(xù)組同復制性衰老細胞組；組蛋白H4(Lys20)整體甲基化趨勢，復制性衰老細胞組升高，早衰持續(xù)組同復制性衰老細胞組。 3.4細胞衰老相關基因表達發(fā)生改變，與其啟動子區(qū)甲基化調控有不同程度關聯(lián)在細胞衰老過程中，與年輕細胞組mRNA表達水平相比，復制性衰老細胞組P53表達升高，中年細胞組顯著升高，而早衰持續(xù)組無明顯變化；中年細胞組P16表達降低，而復制性衰老細胞組明

15、顯升高，早衰持續(xù)組也升高：中年細胞組及復制性衰老細胞組IGF2表達升高，早衰持續(xù)組顯著升高；中年細胞組及復制性衰老細胞組P66表達升高，早衰持續(xù)組升高顯著：復制性衰老細胞組及早衰持續(xù)組FOXA2表達均明顯降低。 4結論: 4.1獲得人胚肺成纖維細胞體外復制性衰老模型及成功建立穩(wěn)定的過氧化氫誘導細胞早衰模型，細胞復制性衰老與細胞早衰具有相同的形態(tài)學特征和增殖能力。 4.2基因組DNA低甲基化，整體組蛋白H3，H4低

16、乙酰化和H4K20高甲基化狀態(tài)是細胞衰老發(fā)生的表觀微環(huán)境，表觀遺傳學相關酶的表達與活性改變參與其形成與維持。 4.3在細胞衰老過程中，特異基因表達發(fā)生變化，其轉錄調控區(qū)域特定的DNA甲基化和組蛋白修飾參與基因的轉錄調控。 4.4細胞復制性衰老與細胞早衰的表觀遺傳學調控機制存在差異，氧化應激可能通過表觀遺傳學修飾的變化作用于細胞早衰的發(fā)生。 4.5獲得人胚肺成纖維細胞年輕階段及復制性衰老階段轉錄調控區(qū)域高甲基化的特