亞洲棉CAP基因的克隆、表達(dá)與蛋白鑒定.pdf

1、本研究以亞洲棉(GossypiumarboreumL.)種質(zhì)DPL971及其無短絨有纖維突變體(DPL972)為材料。從亞洲棉中分離得到腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合蛋白(CAP)的cDNA表達(dá)序列及基因組DNA序列。為深入研究CAP基因?qū)γ蘩w維發(fā)育的作用，對克隆的CAP基因的cDNA序列進(jìn)行了表達(dá)和蛋白表達(dá)純化，還分析了CAP基因在棉纖維早期發(fā)育階段的表達(dá)水平及蛋白性質(zhì)。主要研究結(jié)果包括： 1.對253條棉纖維(表皮毛)發(fā)育相關(guān)基因在DPL

2、971和DPL972基因組中的基因一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。尋找到了與這對材料表型性狀差異緊密相關(guān)的目標(biāo)基因——CAP基因。 2.以DPL971和DPL972為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆了亞洲棉的全長CAP基因-GaCAP和GaCAPm。該基因的開放閱讀框(ORF)有1416nt，共編碼一個(gè)471氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為50.6kDa。核苷酸序列及氨基酸序列的同源性比較表明：GaCAP及GaCAPm與已經(jīng)報(bào)道的其它物種的CAP基因

3、具有有較高的同源性。 3.對CAP基因在野生型和突變體中的表達(dá)譜進(jìn)行了RT-PCR和Northern雜交分析。結(jié)果顯示，CAP基因在野生型和突變體材料的棉纖維發(fā)育早期階段(-1～4DPA)的表達(dá)信號穩(wěn)定。但在突變體材料的4～9DPA階段，CAP基因的表達(dá)量隨著時(shí)間的推移呈下降趨勢，尤其是在9DPA時(shí)，CAP基因僅有痕量表達(dá)。在野生型及突變體材料的葉片、下胚軸和根等組織器官中，均檢測到了CAP基因一定豐度的表達(dá)信號。上述試驗(yàn)結(jié)果顯

4、示，CAP基因在棉花各組織器官中均有表達(dá)，尤其在棉纖維發(fā)育早期階段的胚珠中表達(dá)信號較高；比對CAP基因在野生型及突變體胚珠不同發(fā)育階段的表達(dá)信號，推測CAP基因參與了亞洲棉短絨纖維發(fā)育的起始過程。 4.按所分離的棉花腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合蛋白cDNA序列設(shè)計(jì)、合成特異引物，以亞洲棉葉片DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增分離獲得棉花GaCAP基因DNA序列。利用DNAStar對該基因的序列進(jìn)行分析表明：GaCAP基因編碼區(qū)含有10個(gè)外顯子和9

5、個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子的大小在100～1000bp范圍內(nèi)不等。CAP蛋白在棉花和擬南芥中的序列長度一致(分別為471和476個(gè)氨基酸殘基)，但其在棉花(序列長度約4kb)和擬南芥(序列長度與2.4kb)基因組中的存在情況不同，說明棉花CAP基因內(nèi)含子的復(fù)雜程度較高。 5.多序列比對結(jié)果顯示：GaCAP蛋白的C-末端與擬南芥、苜蓿和水稻的相似度達(dá)到83％，而N-末端的序列相似性分別為74％、73％和63％。表明GaCAP蛋白的C-末端較

6、N-末端更為保守；CAP蛋白的特征序列：RLE重復(fù)基序(RLErepeats)、Actin結(jié)合域(actinbindingdomain)、SH3基序(SH3motif)和多聚結(jié)合域(multimerizationdomain)均定位在預(yù)測的GaCAP蛋白序列之中；GaCAPm編碼的蛋白序列的第44位是蘇氨酸(極性氨基酸)，這與GaCAP編碼蛋白序列的同一位置(丙氨酸，非極性氨基酸)不同，而且在不同物種的CAP蛋白中，該位點(diǎn)是極為保守的，

7、因此，這一位點(diǎn)的突變可引起GaCAPm蛋白的結(jié)構(gòu)和功能變化。 6.以GaCAP基因的cDNA序列為探針與基因組DNA酶切片段進(jìn)行Southernblotting雜交分析，結(jié)果顯示棉花基因組中僅含有一個(gè)CAP基因的拷貝。 7.構(gòu)建了GaCAP原核表達(dá)載體，在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，并純化目的蛋白，進(jìn)行理化分析。結(jié)果顯示，GaCAP蛋白的最適反應(yīng)溫度為36℃，并且可以在一個(gè)較寬的溫度范圍(30～60℃)內(nèi)保持其高結(jié)合活性(＞