靈芝屬菌株特異性分子標記的研究.pdf

1、靈芝在我國已有悠久的應用歷史，可用于多種疾病的治療。近年來，靈芝的栽培生產(chǎn)得到迅速發(fā)展，靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴大，但是我國的靈芝生產(chǎn)用菌種非常混亂，存在同種異名、同名異種的現(xiàn)象，使得靈芝的基礎科研與相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展面臨許多困難。 本研究的目的是尋找靈芝屬菌株的特異性分子標記，建立靈芝屬菌株快速、有效的檢測與鑒定方法，為靈芝菌種的鑒定提供一種新的、快速準確而且費用較低的鑒定方法，為我國保護靈芝菌種的知識產(chǎn)權提供有效檢測手段及技術標

2、準。 本實驗以152株靈芝屬菌株(包括128株來自中國的栽培菌株及24株國外菌株)為材料，根據(jù)本實驗室已完成的ERIC-PCR親緣聚類分析結果，把相似度水平在0.850以上的菌株構成一個DNA池，共建成48個DNA池。 用SRAP引物對48個DNA池進行擴增，篩選獲得1個SRAP特異性標記；用ISSR引物對48個DNA池進行擴增，篩選獲得3個ISSR特異性標記。回收這些特異性條帶，經(jīng)克隆測序后設計了4對SCAR引物，分別

3、為C4A/C4S，C38A/C38S，C39A/C39S，C45A/C45S(C39A/S是通過SRAP獲得，另外三個是通過ISSR獲得)。通過SCAR-PCR擴增驗證，將SRAP標記和ISSR標記均成功的轉(zhuǎn)化為特異性和穩(wěn)定性更好的SCAR標記。 將得到的4個SCAR標記在構成DNA池的152個菌株上驗證。為了保證驗證的準確性，每次都以特異性菌株為陽性對照，擴增結果顯示從C4，C38，C39和C45中獲得的特異性SCAR標記在實

4、驗所用的所有菌株中擴增都是只對應一個菌株，分別是G0014，G0121，G0142和G0126。說明這四個標記都是針對單一菌株的特異性分子標記。實驗結果證實了SCAR特異標記在菌株快速檢測鑒定中的可行性和可靠性。 在篩選到的4個SCAR標記中，因有兩個標記C4(777bp)和C38(774bp)片段大小只相差3bp，在瓊脂糖電泳中不能區(qū)分，因此我們用篩選到的4個SCAR標記建立了兩個多重PCR體系，實現(xiàn)了在同一個反應管內(nèi)同時可檢