核酸恒溫擴增技術檢測結核分枝桿菌的比較研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種人畜共患傳染病，結核分枝桿菌是人和動物結核病的主要病原。人結核病和動物結核病是可以相互傳染的，人類的結核病可以通過呼吸或飛沫傳給人或其他動物，動物結核病除了通過呼吸或飛沫外，還可以通過一些動物產(chǎn)品如肉、奶、蛋等畜產(chǎn)品進行傳播。目前，最為常見的動物結核就是牛結核病，它不僅給畜牧業(yè)帶來嚴重的影響，并且給人類的健康安全也造成了很大的威脅。近年來，人

2、結核病的發(fā)病率明顯上升，特別是兒童腸結核的發(fā)病率明顯增加，有報道顯示，從這些兒童患者中分離的30％的菌株為牛分枝桿菌。結核病的實驗室診斷是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，同時也是確定結核病診斷、切斷傳播途徑并制定治療方案的重要依據(jù)。由于傳統(tǒng)的檢測方法不夠完善，如檢測時間長、靈敏性與特異性不高、對設備要求高等。因此，建立快速、準確、靈敏、價格低廉的結核病實驗室診斷方法對結核病控制有著極為重要的意義。
　　目的：建立一種快速、準確、價格低

3、廉易于臨床推廣的，并可以運用于畜產(chǎn)品中結核分枝桿菌檢測的方法。
　　方法：通過優(yōu)化環(huán)介導等溫擴增檢測技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)與 RNA恒溫擴增實時檢測技術(Simultaneous amplification and testing，SAT)的反應條件與體系，建立起兩種可以用于牛乳中結核分枝桿菌檢測的核酸擴增方法。本實驗通過對牛奶中結核分枝桿菌的 DNA和 RN

4、A的提取方法以及對每種方法的反應體系、反應溫度、反應時間進行優(yōu)化，并對牛乳中結核分枝桿菌檢測的靈敏度、特異性、重復性進行檢測，確定這兩種方法對牛乳中結核分枝桿菌的最低檢測濃度（靈敏度）。同時還將環(huán)介導等溫擴增技術與RNA恒溫擴增實時檢測技術同結核羅氏培養(yǎng)技術、抗酸染色鏡檢、PCR技術進行比較，評價與分析各種檢測方法對牛乳中結核分枝桿菌的檢測結果，以確定最佳檢測方法，為臨床應用提供參考依據(jù)。
　　結果：環(huán)介導等溫擴增技術和 RNA恒

5、溫擴增實時檢測技術的靈敏度、特異性、重復性都比較高，對牛乳中結核分枝桿菌的最低檢測濃度分別為3×101 CFU/mL和3×100 CFU/mL。 RNA恒溫擴增實時檢測技術的靈敏度要明顯高于環(huán)介導恒溫擴增技術，并且是它的10倍。牛乳中結核分枝桿菌的 DNA與 RNA的提取方法分別為改良后的 CTAB/NACL法與改良后的手工提取 RNA法。結核培養(yǎng)技術、抗酸鏡檢、PCR技術對牛乳中結核分枝桿菌的檢測的最低濃度分別為3×105 CFU/m