核盤菌低毒菌株SX466的生物學(xué)特性及所含真菌病毒的相關(guān)研究.pdf

1、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是油菜等許多作物上的重要病害，目前對(duì)這一病害缺乏經(jīng)濟(jì)、有效及穩(wěn)定的防治措施，急需探討新的防治策略。利用由真菌病毒引起核盤菌致病力衰退，對(duì)生物防治菌核病具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究以陜西省漢中市發(fā)病油菜莖稈內(nèi)菌核分離的SX466為材料，它的菌絲為短絨毛狀、菌落邊緣致密、表面上形成大量白色氣生菌絲、菌絲尖端彎曲、菌絲生長(zhǎng)速度緩慢、不產(chǎn)生菌核、致病力弱、表現(xiàn)出明顯

2、的低毒現(xiàn)象。經(jīng)克隆分析發(fā)現(xiàn)它攜帶了三種真菌病毒:Sclerotinia sclerotiorum megabirna virus1(SsMBV1)，基于RdRp的進(jìn)化分析，清楚的表明它和Rosellinia necatrix megabimavirus1（RnMBV1）親緣關(guān)系最近，相似率44％; Sclerotinia sclerotiorun mitovirus2/SX466(SsMV2/SX466)和Sclerotinia scl

3、erotiorum mitovirus2的另兩個(gè)種同源性高度92％; Sclerotinia sclerotiorum partitivirus/SX466(SsPV/SX466)和Grapevinepartitivirus(GPV)有60％相似度，本文重點(diǎn)研究SsMBV1。
　　SsMBV1的基因組cDNA全長(zhǎng)由兩條dsRNA片段構(gòu)成，L1-dsRNA有8806 bp，L2-dsRNA有7909 bp。它可形成直徑約45 nm的

4、球形病毒粒子，病毒粒子蛋白指紋圖譜分析結(jié)果表明，SsMBV1的外殼蛋白主要由ORF1編碼的CP組成。L1-dsRNA有兩個(gè)閱讀框（ORF1和ORF2），分別編碼CP蛋白和RdRp蛋白。ORF1和ORF2沒(méi)有重疊區(qū)域，中間間隔114 bp，但在ORF2起始密碼子上游有一段不含終止密碼子的區(qū)域，位于ORF1終止密碼子的上游，存在典型的七核苷酸移碼motif“XXXYYYZ”，靠近它下游的位置存在假定RNA“假結(jié)體”，二者具備核糖體移碼的條件

5、，因此，ORF2可以通過(guò)核糖體移碼與ORF1形成一個(gè)融合蛋白。L2-dsRNA有兩個(gè)閱讀框（ORFA和ORFB），編碼兩個(gè)功能未知的蛋白。推定的ORFA編碼蛋白的N末端215-306 aa位置，有一個(gè)蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Peptidase_C7，pfam01830)，它和已知的Cryphonectria hypovirus1(CHV1)木瓜半胱氨酸蛋白酶樣蛋白p29有29％的相似度，表明二者親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，推定可能是在ssRNA病毒與dsR

6、NA病毒間發(fā)生了水平基因轉(zhuǎn)移。通過(guò)序列比對(duì)分析，可以很明顯看出L1-dsRNA和L2-dsRNA的5'末端序列有高達(dá)98％相似度。二者5'末端前250nts完全一樣，高度保守，形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而3'末端沒(méi)有明顯保守區(qū)域，也能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　SsMBV1可以通過(guò)核盤菌菌絲融合的方式水平傳播給營(yíng)養(yǎng)體不親和的核盤菌無(wú)毒菌株1980hyg，并可形成和SX466中一樣大小的病毒粒子，如1980hygV1和1980hygV3，而且還發(fā)

7、現(xiàn)在傳遞過(guò)程中L2-dsRNA丟失，如1980hygV2。SsMBV1的病毒粒子可以直接侵染核盤菌無(wú)病毒菌株的原生質(zhì)體，再生的菌株核酸帶型、病毒粒子形態(tài)均和SX466中的相似，如A367RV1和A367RV2。同樣發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染過(guò)程中L2-dsRNA可以丟失，如A367RV3和A367RV4?？梢?jiàn)病毒粒子在形成過(guò)程中L1-dsRNA和L2-dsRNA是分別單獨(dú)組裝成病毒粒子。RT-PCR和Northern雜交試驗(yàn)進(jìn)一步證明了SsMBV1序列

8、的特異性以及L2-dsRNA丟失的現(xiàn)象。
　　通過(guò)水平傳播試驗(yàn)和PEG介導(dǎo)的病毒粒子轉(zhuǎn)染核盤菌原生質(zhì)體試驗(yàn)均證明了SsMBV1可以傳播，而且L2-dsRNA/SsMBV1可以丟失。兩種類型的水平傳播衍生菌株和轉(zhuǎn)染子間菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度和致病力均沒(méi)有顯著差異，可見(jiàn)L2-dsRNA/SsMBV1對(duì)寄主真菌的表型沒(méi)有影響或影響很小。RT-PCR和qPCR檢測(cè)進(jìn)一步證明了L2-dsRNA/SsMBV1丟失，當(dāng)L2-dsRNA丟失后，L1-

9、dsRNA的表達(dá)量比沒(méi)丟失的表達(dá)量低，推定L2-dsRNA可能會(huì)促進(jìn)L1-dsRNA的累積。丟失L2-dsRNA/ SsMBV1的菌株中病毒粒子數(shù)量明顯少于不丟失的菌株，可見(jiàn)，L2-dsRNA/ SsMBV1會(huì)影響病毒粒子的穩(wěn)定性。
　　為了研究L2-dsRNA/SsMBV1的功能，采用基因沉默技術(shù)，分別構(gòu)建了L2-dsRNA中ORFA編碼的類似p29蛋白的基因和L1-dsRNA中ORF2編碼的RdRp基因的RNAi沉默載體，通過(guò)

10、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)和原始菌株SX466相似，而且仍能檢測(cè)到較亮的核酸條帶，沉默效果不佳。
　　通過(guò)對(duì)Ep-1PNA367/A367RV1/A367RV3高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，三個(gè)菌株中存在一些差異表達(dá)基因，這些基因參與了次生代謝產(chǎn)物合成的代謝途徑，包括如細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450s)、非核糖體多肽合成酶(Nonribosomal Peptide Synthetase，NRPSs)以及單加氧酶(M