c-Jun基因啟動子區(qū)的遺傳變異與肺癌易感性的研究.pdf

1、研究背景:
　　肺癌是當(dāng)今世界上許多國家最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因、多階段共同作用的過程。環(huán)境危險因素可以激活多種核轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而參與調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而引發(fā)腫瘤。激活蛋白-1（activated-protein1，AP-1）是一種參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、腫瘤形成以及腫瘤轉(zhuǎn)移的核轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)活化的AP-1可直接結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)的AP-1結(jié)合位點(diǎn)而調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。A

2、P-1是由Jun（c-Jun、JunB、JunD）和Fos（c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2）兩大類蛋白家族組成的同源或異源二聚體復(fù)合物。目前已報道AP-1在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)AP-1的主要成員c-Jun和c-Fos在肺癌組織中的高表達(dá)。前期研究發(fā)現(xiàn)c-Jun基因啟動子區(qū)存在功能性遺傳變異（-1318T>G、-673T>C）且能影響該基因的表達(dá)從而增加中國南方人群散發(fā)性結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險。因此，我們假設(shè)c-

3、Jun、c-Fos基因啟動子區(qū)的遺傳變異與我國人群肺癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)。
　　研究目的:
　　探討c-Jun、c-Fos基因啟動子區(qū)的遺傳變異與中國人群肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)，分析基因-基因以及基因-環(huán)境交互作用對肺癌發(fā)病的影響，并進(jìn)一步通過功能實驗揭示上述基因遺傳變異與肺癌發(fā)病關(guān)聯(lián)的分子生物學(xué)實質(zhì)，為肺癌的預(yù)防、診斷、治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:
　　本研究采用雙中心病例-對照研究，在廣州地區(qū)和蘇州地區(qū)共收集1559例

4、肺癌病例，并按性別相同、年齡相近成組配比的方式選取健康對照1679例；通過生物信息學(xué)分析篩選并選取c-Jun、c-Fos基因啟動子區(qū)3個常見的多態(tài)位點(diǎn)[最低等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）>5％的稱為常見多態(tài)位點(diǎn)]，包括c-Jun基因rs2760501（-1318T>G）、rs4646999（-673T>C）和c-Fos基因rs7101（-60C>T）；利用TaqMan法檢測廣州人群三個多態(tài)位點(diǎn)的基因

5、型，并探索不同等位基因和基因型與肺癌的關(guān)聯(lián)，繼而在蘇州地區(qū)收集503例肺癌和623例健康對照驗證陽性位點(diǎn)與肺癌關(guān)聯(lián)；采用Logistic回歸分析不同等位基因，基因型及單體型與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)，并應(yīng)用相乘交互作用模型探討基因-基因及基因-環(huán)境的交互作用對肺癌發(fā)病的影響；進(jìn)一步通過qRT-PCR、Western Blot、螢光素酶報告基因試驗深入研究上述基因的遺傳變異的功能實質(zhì)。
　　研究結(jié)果:
　　一、c-Jun和c-Fos基因

6、多態(tài)性以及基因-環(huán)境的交互作用與肺癌發(fā)病的相關(guān)性
　　在兩個人群的對照組中，-1318T>G、-673T>C、-60C>T三個位點(diǎn)基因型頻率分布都符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），這說明對照組符合隨機(jī)人群分布的標(biāo)準(zhǔn)。廣州人群研究顯示，c-Jun基因的多態(tài)位點(diǎn)-1318T>G、-673T>C在肺癌病例和對照組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001，0.0014）。多因素非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，校正年

7、齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史等混雜因素后，對于-1318T>G位點(diǎn)，以攜帶TT野生基因型個體為參照，TG基因型攜帶者發(fā)生肺癌的風(fēng)險增加47%（校正OR＝1.47，95%CI＝1.22-1.77，P<0.001），GG攜帶者發(fā)生肺癌的危險性進(jìn)一步增加到69%（校正OR＝1.69，95%CI＝1.12-2.57，P＝0.013），且肺癌發(fā)病風(fēng)險與G變異等位基因的個數(shù)存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系（校正P趨勢<0.001），按照赤池信息量準(zhǔn)則（

8、Akaikes information criterion，AIC），-1318T>G的遺傳模型為顯性遺傳模型，進(jìn)一步將變異基因型進(jìn)行二分類合并，發(fā)現(xiàn)攜帶G變異基因型（-1318TG＋GG）個體可顯著增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險（校正OR＝1.49，95%CI＝1.25-1.79，P<0.001）。對于-673T>C多態(tài)，以TT攜帶者為參照，攜帶CC純合子個體發(fā)生肺癌的風(fēng)險顯著增加29%（校正OR＝1.29，95%CI＝1.02-1.64，P＝0

9、.035），而CT雜合子攜帶者沒有增加肺癌發(fā)病風(fēng)險（P＝0.465），根據(jù)AIC準(zhǔn)則，-673T>C符合隱性遺傳模型，與-673T（TT+CT）基因型攜帶者相比，變異型CC基因型攜帶者發(fā)生肺癌的風(fēng)險性顯著增加了37%（OR＝1.37，95%CI＝1.14-1.64，P<0.001）。此外，c-Fos基因-60C>T多態(tài)的基因型和等位基因頻率在肺癌組和對照組的分布皆無顯著性差異（P值分別為0.263，0.190）。
　　在蘇州人群，

10、我們對上述的陽性位點(diǎn)進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)：與廣州人群研究結(jié)果一致，多態(tài)位點(diǎn)-1318T>G、-673T>C皆可顯著增加人群肺癌的發(fā)病風(fēng)險，攜帶-1318G變異基因型（TG＋GG）個體發(fā)生肺癌的風(fēng)險增加39%（校正OR＝1.39，95%CI＝1.08-1.77，P＝0.010），-673CC基因型攜帶者患肺癌風(fēng)險增加32%（OR＝1.32，95%CI＝1.03-1.69，P＝0.032）。
　　通過同質(zhì)性檢驗發(fā)現(xiàn)廣州人群、蘇州人群與肺癌

11、的關(guān)聯(lián)具有同質(zhì)性（-1318T>G：Breslow-Day檢驗P=0.776；-673T>C：Breslow-Day檢驗P=0.797），因此我們將兩人群合并以提高統(tǒng)計效能并分析上述陽性位點(diǎn)與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示：攜帶-1318G變異基因型（TG＋GG）個體肺癌發(fā)病風(fēng)險顯著增加（校正OR＝1.46，95%CI＝1.26-1.69，P<0.001，Bonferroni adjust P<0.001）；-673CC基因型個體發(fā)生肺癌的風(fēng)

12、險性顯著增加（校正OR＝1.35，95%CI＝1.17-1.56，P<0.001，Bonferroni adjust P<0.001）。
　　連鎖不平衡分析顯示-1318T>G與-673T>C存在較弱的連鎖特征(D’=0.184，r2=0.015)，因此我們進(jìn)行了單體型（Haplotype）分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-Jun基因兩個多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建的四個單體型-1318T-673T、-1318T-673C、-1318G-673T、-1318G

13、-673C在肺癌病例和對照間分布頻率存在顯著性差異（P<0.001）。Logstic回歸分析顯示，以攜帶-1318T-673T單體型個體為參照，攜帶-1318T-673C、-1318G-673T、-1318G-673C單體型個體發(fā)生肺癌的風(fēng)險皆顯著增加（-1318T-673C：校正OR＝1.19，95%CI＝1.07-1.34，P＝0.0018；-1318G-673T：校正OR＝1.51，95%CI＝1.27-1.81，P<0.001；

14、-1318G-673C：校正OR＝1.60，95%CI＝1.33-1.92，P<0.001）。進(jìn)一步將c-Jun基因兩個多態(tài)位點(diǎn)的危險基因型（-1318TG/GG和-673CC）進(jìn)行組合（0，1，2），以攜帶0個危險基因型個體為參照，攜帶危險基因型個體發(fā)生肺癌的風(fēng)險顯著增加（1個危險基因型：校正OR＝1.52，95%CI＝1.31-1.77；2個危險基因型：校正OR＝1.97，95%CI＝1.55-2.50），且隨著危險基因型的個數(shù)增加

15、，肺癌發(fā)病風(fēng)險也隨之增加（P趨勢<0.001）。
　　此外，分層分析和交互作用分析發(fā)現(xiàn)吸煙和飲酒與危險基因型個數(shù)存在顯著的基因-環(huán)境交互作用（P吸煙=0.009，P飲酒=0.007）。
　　二、c-Jun基因啟動子區(qū)遺傳變異對c-Jun基因表達(dá)及啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　為分析c-Jun基因型與表型（基因表達(dá)）間的關(guān)系，進(jìn)一步在32例肺癌組織中檢測c-Jun基因多態(tài)位點(diǎn)不同基因型對c-Jun mRNA、c-Jun蛋白表

16、達(dá)的影響，結(jié)果顯示：變異等位基因G（-1318GT/GG）攜帶者的c-Jun mRNA表達(dá)水平高于野生型攜帶者（P=0.002），-673CC攜帶者的c-Jun mRNA表達(dá)水平高于攜帶-673CT/TT基因型個體（P=0.003）；同樣，比較危險基因型攜帶者和不攜帶危險基因型者c-Jun mRNA在肺癌組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)攜帶1個和2個危險基因型個體c-Jun mRNA表達(dá)水平高于不攜帶者（ANOVA檢驗P<0.001，線性回歸P<

17、0.001）；-1318GT/GG基因型攜帶者c-Jun蛋白的表達(dá)水平高于-1318TT攜帶者（P=0.038），-673CC攜帶者c-Jun蛋白的表達(dá)水平明顯高于攜帶-673CT/TT個體（P=0.022）；同樣，攜帶1個和2個危險基因型患者c-Jun蛋白的表達(dá)水平與攜帶0危險基因型個體的表達(dá)也是有差異的（ANOVA檢驗P=0.017，線性回歸P=0.005）。
　　為了在體外檢測c-Jun基因多態(tài)位點(diǎn)-673T>C、-1318

18、T>G對啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響，本研究分別構(gòu)建了僅含-673T>C多態(tài)兩個等位基因的短片段啟動子序列的報告基因質(zhì)粒（p-673T和p-673C）以及包含-1318T>G，-673T>C兩多態(tài)位點(diǎn)四種單體型的長片段啟動子序列的報告基因質(zhì)粒（p-G-C，p-G-T，p-T-C和p-T-T）。將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人肺腺癌細(xì)胞系（A549）和人肺鱗癌細(xì)胞系（NCI-H520），檢測不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性的差異發(fā)現(xiàn)：p-673C的轉(zhuǎn)錄活性顯著高于p-6

19、73T的轉(zhuǎn)錄活性高（PA549=0.011，PNCI-H520=0.006），同時還發(fā)現(xiàn)p-G-C，p-G-T，p-T-C的轉(zhuǎn)錄活性也高于p-T-T的轉(zhuǎn)錄活性（PA549<0.001，PNCI-H520<0.001），且以 p-G-C質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性最高，表明-1318T>G，-673T>C兩變異位點(diǎn)皆可提高c-Jun基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；此外，通過添加煙草提取物和乙醇乙醛混合物模擬實驗發(fā)現(xiàn)，上述報告基因的轉(zhuǎn)錄活性較未添加組顯著增加，且增

20、加幅度以-1318G-673C單體型最大。這提示，煙草提取物、乙醇乙醛混合物可能會影響c-Jun基因啟動子的轉(zhuǎn)錄能力。
　　研究結(jié)論:
　?。?）c-Jun基因啟動子的多態(tài)位點(diǎn)-1318T>G、-673T>C能顯著增加我國人群肺癌的發(fā)病風(fēng)險。
　　（2）-1318T>G、-673T>C多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建的4種單體型，與攜帶單體型-1318T-673T個體相比較，-1318T-673C、-1318G-673T、-1318G-6

21、73C單體型攜帶者發(fā)生肺癌的風(fēng)險顯著增加。
　　（3）將c-Jun基因兩個多態(tài)位點(diǎn)-1318T>G、-673T>C的危險基因型進(jìn)行組（0，1，2），以不攜帶危險基因型（0個）個體為參照，發(fā)現(xiàn)攜帶危險基因型個體顯著增加肺癌發(fā)病風(fēng)險，且隨著危險基因型的個數(shù)增加，肺癌發(fā)病風(fēng)險也隨之增加。
　?。?）吸煙、飲酒與危險基因型個數(shù)在增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險上存在交互作用。
　?。?）c-Jun基因的多態(tài)位點(diǎn)-1318T>G、-673T>

22、C與c-Jun基因表型存在顯著的關(guān)聯(lián)。在肺癌組織中攜帶-1318TG/GG個體c-Jun mRNA、c-Jun蛋白的表達(dá)均高于-1318TT攜帶者；-673CC攜帶者肺癌組織中c-Jun mRNA、c-Jun蛋白的表達(dá)也高于-673CT/TT攜帶者。
　?。?）在A549、NCI-H520細(xì)胞株，煙草提取物（CSE）和乙醇乙醛混合物增加c-Jun基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，其中在含有兩個變異等位基因質(zhì)粒p-G-C的轉(zhuǎn)錄活性最高。