miRNAs成熟體的遺傳變異與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是危害人類生命健康最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在全球大部分國家和地區(qū)均位居各類癌癥之首。由于缺乏有效的早期診斷方法以及有效的治療手段，肺癌的預后較差，其5年存活率不到20％。肺癌的科學防治已成為全球共同關(guān)注的熱點和公共衛(wèi)生問題。隨著國家工業(yè)化進程、環(huán)境污染的不斷加劇，我國人群肺癌的發(fā)病率和死亡率迅速增長，已超過世界的平均水平，且目前仍呈不斷上升的趨勢，嚴重威脅我國居民的生命健康。研究顯示，吸煙是導致肺

2、癌的最主要環(huán)境因素，80%肺癌的發(fā)生與吸煙有著重要的聯(lián)系，但只有10%~15%吸煙者會得肺癌，且部分不吸煙者同樣會因得肺癌而死亡，提示肺癌可能與個體遺傳有關(guān)，遺傳因素在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。愈來愈多的證據(jù)顯示，肺癌是一個多因素影響的復雜疾病，其發(fā)生是環(huán)境與遺傳因素相互作用的結(jié)果。
　　微小RNA（microRNA,miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類保守的、非編碼小分子RNA,長度約22~24nt，通過與靶基因mRNA3’-非翻

3、譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)的堿基互補配對，引起mRNA的降解或者翻譯抑制，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達水平。研究表明，miRNAs參與了細胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤發(fā)生、侵襲等多種生理病理過程，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著“癌基因”或者“抑癌基因”的類似角色。2002年研究者首次發(fā)現(xiàn)miRNAs有抑制腫瘤發(fā)生的作用，在大約68%的B細胞慢性淋巴白血病中，miR-15和miR-16存在缺失或下調(diào)；miR-1

4、5和miR-16可以負調(diào)控B細胞淋巴瘤2基因(B cell lymphoma2，BCL-2)，而BCL-2是一種抗凋亡癌基因并在多種腫瘤中過表達，因此推測miR-15和miR-16起著抑癌基因的作用。Takamizawa等人首次發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中miRNAs的表達異常。通過檢測143個手術(shù)切除的肺癌組織標本中miRNAs的表達，發(fā)現(xiàn)miRNA let-7的表達降低與患者術(shù)后生存時間密切相關(guān)；體外實驗證實把let-7導入肺腺癌細胞系A549

5、后可以抑制腫瘤細胞的生長。Hayashita等人研究發(fā)現(xiàn)miR-17-92簇，包括hsa-miR-17-5p,hsa-miR-17-3p，hsa-miR-18a，has-miR-19a，hsa-miR-19b-1，hsa-miR-20a和hsa-miR-92，在肺癌中有顯著的過表達，尤其是在小細胞肺癌組織中；把miR-17-92轉(zhuǎn)染入A549細胞，能促進細胞增殖，而將其成員如miR-18a、miR-19a、miR-20a單獨轉(zhuǎn)染入A54

6、9中并不能促進細胞增殖，提示miR-17-92家族作為一個整體而發(fā)揮作用。Cho等通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-126、hsa-miR-145、hsa-miR-21、hsa-miR-182、hsa-miR-183和hsa-miR-210在肺癌及正常組織中表達差異顯著。最新一項研究顯示，miR-193b在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中表達下調(diào)，在A549細胞中導入miR-

7、193b可以抑制其生長、遷移和侵襲能力，且能抑制細胞周期蛋白D1和尿激酶型纖溶酶的活化。Markou等人發(fā)現(xiàn)，對于NSCLC病人的生存期，has-miR-21的過表達可作為一個獨立的負性預后標志物。越來越多的證據(jù)顯示了miRNAs的表達變化與各種腫瘤的關(guān)聯(lián)。miRNAs家族已經(jīng)被公認為基因表達調(diào)控網(wǎng)絡中的關(guān)鍵成員，影響著信號轉(zhuǎn)導通路中下游基因，尤其是腫瘤相關(guān)基因的功能。因此，通過對miRNAs在不同腫瘤的序列分析、特定表達水平、以及探討

8、腫瘤相關(guān)靶基因等有利于進一步認識miRNAs在疾病中的生物學作用。
　　單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人類基因組最常見的遺傳變異。大量的流行病學研究顯示SNP改變可以影響腫瘤（包括肺癌）形成、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預后等過程。鑒于miRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡中扮演的重要角色，位于miRNA基因序列的遺傳變異是否會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也逐漸受到研究者的關(guān)注。已有文獻報道，位于miRNA成

9、熟體區(qū)域的遺傳變異影響其自身加工成熟過程，亦可改變與相關(guān)靶基因的互補配對能力，從而導致不同的生物學效應。有研究發(fā)現(xiàn)，位于miR-125a成熟體的一個SNP(G>T)能阻礙pri-miR125a到pre-miR125a的轉(zhuǎn)變，從而使成熟miR-125a表達下調(diào)；體外實驗證實該SNP削弱了miR-125a與靶基因lin-28的結(jié)合能力，使其對lin-28的翻譯抑制功能受限；而lin-28蛋白的過度積累可能會促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)化和侵襲。近年來越

10、來越多的報道顯示，miRNAs基因序列的遺傳變異與肺癌的發(fā)病、治療和預后等亦有密切的關(guān)系。miRNAs，作為一類新型的基因調(diào)節(jié)小分子，有望為闡明肺癌發(fā)病的具體生物學機制提供一條新的途徑。
　　因此，我們經(jīng)生物信息學分析，基于miRBase（18.0版本，截止至1/1/2012）和HapMap(HapMap Data Rel28 PhaseII+III,Auegest10,on NCBI B36 assembly,dbSNP b12

11、6,截止至1/1/2012)公共數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，針對已報道的人類所有miRNAs，篩選出位于miRNA成熟體區(qū)域且在中國人群常見的SNPs位點（低發(fā)等位基因頻率>0.05,minor allele frequency,MAF），并通過兩中心大樣本的病例對照研究，探討miRNAs成熟體區(qū)域的遺傳變異與肺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)，為肺癌預防、生物學標志物的篩選提供科學依據(jù)。
　　研究目的：
　　分析位于miRNA成熟體區(qū)域且是在中國人群中

12、常見的遺傳變異位點與人群肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)，探討基因及基因-環(huán)境交互作用在肺癌發(fā)病中的作用，為肺癌高危人群或易感個體的篩選及肺癌的早期診斷和預防提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　運用生物信息學系統(tǒng)分析，篩選出位于miRNA成熟體區(qū)域且是在中國人群中常見的多態(tài)位點；并通過廣州-蘇州兩中心的病例-對照研究探討這些多態(tài)位點與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)。其中，廣州地區(qū)人群作為發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)的人群，包括1056例肺癌病例和1056例健康正常對照，蘇州地區(qū)

13、人群作為驗證關(guān)聯(lián)的人群，包括503例肺癌病例和623例健康對照。采用TaqMan技術(shù)檢測所選取的多態(tài)位點的基因型，用SAS9.13統(tǒng)計軟件分析人群的人口學特征、篩選出危險因素；采用非條件多因素Logistic回歸模型，分析基因變異與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)及“基因-環(huán)境”的交互作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.1研究對象的人口學特征及單因素分析
　　廣州地區(qū)1056例肺癌中，按病理類型分類，包括384例腺癌（36.4%），369例

14、鱗癌（34.9%），43例大細胞肺癌（4.1%），128例小細胞肺癌（12.1%），132例為其他類型（如腺鱗癌、混合型肺癌，占12.5%）；按病理分期I~IV期的比例分別為14.5%（154例）、9.0%（94例）、31.5%（333例）及45.0%（475例）。蘇州地區(qū)503例肺癌患者中，包括231例腺癌（45.9%），158例鱗癌（31.4%）,23例大細胞癌（4.6%），65例小細胞癌（12.9%），26例其他類型肺癌（5.2%

15、）；按病例分期，I期46例（9.2%），II期53例（10.5%），III期157例（31.2%），IV期247例（49.1%）。單因素分析顯示，年齡、性別、肺癌家族史在廣州、蘇州地區(qū)人群病例和對照組的分布差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）；而飲酒、吸煙、年吸煙量在兩中心人群的病例與對照組中則差異顯著（廣州人群：P值分別為0.042、0.028和0.000；蘇州人群：P值分別為0.017、0.000和0.011），說明以上因素是肺癌發(fā)病

16、的危險因素。
　　1.2 miRNAs成熟體區(qū)域的多態(tài)位點的生物信息學分析
　　miRNA公共數(shù)據(jù)庫miRBase（http://mirbase.org，截止至1/1/2012）發(fā)布的人類miRNA序列信息，共1424個。經(jīng)過生物信息學系統(tǒng)分析，位于miRNA成熟體區(qū)域的多態(tài)位點共有205個，其中在中國人群中常見(MAF>0.05)位點有5個，包括
　　hsa-mir-499(rs3746444T>C)、hsa-mir

17、-608(rs4919510C>G)、
　　hsa-mir-3152(rs13299349G>A)、hsa-mir-4513(rs2168518G>A)、
　　hsa-mir-4520a(rs8078913T>C)。
　　1.3 miRNAs成熟體SNP與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)分析
　　在廣州人群對照組中，我們選取的5個單核甘酸多態(tài)位點的基因型頻率均符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibriu

18、m，HWE）（P值均>0.05）。在廣州地區(qū)人群中，我們發(fā)現(xiàn)miR-499 rs3746444T>C多態(tài)與肺癌發(fā)病風險相關(guān)。以攜帶TT野生基因型的個體為參照，攜帶變異基因型（CT+CC）的個體發(fā)生肺癌的風險增加34%(校正OR=1.34;95%CI=1.11-1.62)；且rs3746444C等位基因變異數(shù)目與肺癌發(fā)病風險具有顯著的劑量-反應關(guān)系（Ptrend=0.000）。上述關(guān)聯(lián)在蘇州地區(qū)人群驗證中也得到一致的結(jié)果，攜帶rs3746

19、444（CT+CC）變異基因型的個體發(fā)生肺癌的風險是攜帶TT野生基因型的1.38倍（校正OR=1.38;95%CI=1.07-1.80）。同質(zhì)性檢驗顯示兩中心人群基因型分布一致（Breslow-Day檢驗，P=0.704），因此合并人群分析以增大檢驗效能。以rs3746444TT野生基因型個體為參照，CT雜合基因型的攜帶者患肺癌的風險是TT基因型攜帶者的1.19倍(校正OR=1.19；95%CI=1.01-1.40)，而CC基因型的攜帶

20、者則增加1.75倍(校正OR=2.75；95%CI=1.92-3.92)；將變異C基因型(CT+CC)合并做二分類處理，rs3746444C變異基因型(CT+CC)的個體罹患肺癌危險性增加37%(校正OR=1.35；95%CI=1.16-1.57)。然而對于其他多態(tài)位點，未發(fā)現(xiàn)其基因頻率和等位基因頻率在病例和對照存在顯著性差異（P均>0.05），提示這些位點可能與人群肺癌易感性無關(guān)聯(lián)。
　　1.4分層分析
　　進一步分層分析

21、發(fā)現(xiàn)，與攜帶 rs3746444TT基因型比較，攜帶 C變異基因型(CT+CC)的個體發(fā)生肺癌的危險性在無肺癌家族史、無腫瘤家族史的人群中更為顯著（分別對應OR=1.36，95%CI=1.16-1.58；OR=1.35,95%CI=1.15-1.58），但同質(zhì)性檢驗顯示該位點變異基因型的危險遺傳效應在各亞組間并無顯著差異（P值分別為0.860和0.899）。
　　本研究創(chuàng)新之處
　　既往研究已報道部分miRNAs的遺傳變異與