肺癌遺傳易感性理論與方法學(xué)研究.pdf

1、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士研究生學(xué)位論文肺癌連傳易感性理論與方法學(xué)研究博士研究生:指導(dǎo)老師:吳曉明周宜開摘要廠肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病，越來越多的研究表明肺癌的發(fā)生存在遺傳易感因素.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種墓因的多態(tài)性與肺癌發(fā)生有關(guān)，如1相代謝酶基因細(xì)胞色素P40511相代謝酶基因谷就甘膚轉(zhuǎn)移酶、DNA損傷修復(fù)酶基因等。基因多態(tài)性的表現(xiàn)形式多種多樣，但單個(gè)核普酸的替代，即單核普酸多態(tài)性為目前研究的熱點(diǎn)。經(jīng)典的基于凝膠的基因多態(tài)性檢測(cè)方法由于

2、操作復(fù)雜、準(zhǔn)確性差、接觸有毒有害物質(zhì)而且不能自動(dòng)化而逐漸淘汰基于熒光和芯片的技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化而且是高通量檢測(cè)代表未來發(fā)展的方向，但其需要昂貴的設(shè)備和特定的技術(shù)防礙了目前在國(guó)內(nèi)的廣泛使用。因此建立一種快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉而且具有高通量前景的方法十分必要。鑒于此)我們建立了一種基于錯(cuò)配雜交，采用酶聯(lián)免疫或化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)的基因突變鑒定方法。針對(duì)每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩根寡核普酸探針，兩根探針的區(qū)別僅在于突變位點(diǎn)處一個(gè)堿基，即分別與野生型

3、和突變型DNA片段完全匹配。每個(gè)樣品分別與兩根探針進(jìn)行雜交，以酶聯(lián)免疫或化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交產(chǎn)物。在合適的雜交條件下，完全匹配與不完全匹配的雜交產(chǎn)物穩(wěn)定性不同，利用二者的雜交信號(hào)強(qiáng)度之比確定基因型。我們將此方法應(yīng)用于細(xì)胞色素P4501A1基因兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)，證實(shí)了其實(shí)際應(yīng)用的可行性.乙DNA損傷修復(fù)是維持人體墓因組穩(wěn)定，防止癌癥發(fā)生的重要機(jī)制，包括核普酸切除修復(fù)(NER)、錯(cuò)配修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)、堿基切除修復(fù)等4個(gè)主要途徑。其中NER

4、機(jī)制因?yàn)榭梢孕迯?fù)多種致癌物質(zhì)引起的DNA加合物而在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有流行病學(xué)研究表明肺癌患者NER基因表達(dá)較對(duì)照人群明顯降低，因此我們想證實(shí)NER‘因表達(dá)水平是否可以作為肺癌易感性的生物標(biāo)司苯并(a‘是一種已知的環(huán)境致癌物質(zhì)，是肺癌發(fā)生的直接原因，其造成的DNA損傷主要通過NER途徑修復(fù)。我們采用一肺腺癌細(xì)胞株作為研究對(duì)象，以不同濃度的苯并(a)花處理細(xì)胞。結(jié)果表明低劑量苯并(a)花(IAM)可以誘導(dǎo)細(xì)胞NER基因表達(dá)上

5、升，細(xì)胞DNA損傷程度較輕高劑量苯并(a花(10pm)抑制細(xì)胞NER基因表達(dá)，細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重。因此，NER墓因表達(dá)水平可以評(píng)價(jià)DNA修奧能力，作為肺癌易感性的檢測(cè)指標(biāo)?！籺摘要華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士研究生學(xué)位論文%4.0%和9.5%日間變異分別為5.0%8.7%和12.9%m位點(diǎn)，三種基因型日內(nèi)變異為7.0%5.1%和11.2%日間變異為11.0%8.9%和14.3。為證實(shí)此方法應(yīng)用于大量樣品時(shí)的可行性，我們隨機(jī)檢測(cè)了50個(gè)

6、樣品。m:位點(diǎn)中，22個(gè)野生型樣品平均比值為2.04(SD=O.12CV=6.0%)20個(gè)雜合型樣品平均比值為0.78(SD=0.072CV=9.2%)8個(gè)突變型樣品平均比值為0.33(SD=0.045CV=13.8%)m位點(diǎn)中，24個(gè)野生型樣品平均比值為4.36(SD=0.50CV=11.50%)21個(gè)雜合型樣品平均比值為0.63(SD=0.064CV=10.10%)5個(gè)突變型樣品平均比值為0.060(SD=0.0093CV=15.6

7、%0)。三種基因型樣品的比值分別位于三個(gè)互不重疊的區(qū)域內(nèi)，證實(shí)了該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性.另外，我們對(duì)采用的辣根過氧化物酶ABTS檢測(cè)體系進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。該系統(tǒng)具有良好的線性關(guān)系和重復(fù)性(r=0.999CV=3.2%)以顯色時(shí)問不超過30min衡量，檢測(cè)限為6.25ng25mUml人ntiDigPOD可以滿足實(shí)驗(yàn)要求而且ABTS顯色時(shí)間對(duì)比值影響很小，因此不同量的PCR產(chǎn)物可以同時(shí)進(jìn)行分析?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè):首先，我

8、們對(duì)辣根過氧化物酶一魯米諾一過氧化氫一對(duì)碘苯酚化學(xué)發(fā)光體系進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)光動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明發(fā)光反應(yīng)啟動(dòng)2分鐘后，發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)入平臺(tái)期4Ngml鏈酶親合素包被的發(fā)光管檢測(cè)效果最好1:10。稀釋的發(fā)光底物具有最佳的相關(guān)性和重復(fù)性。我們選擇水為雜交緩沖體系，以降低雜交溫度，簡(jiǎn)化后續(xù)操作過程。。:位點(diǎn)中，野生型樣品與完全匹配及不完全匹配檢測(cè)探針的TM值分別為380C和300C突變型樣品與兩種探針的TM值分別為420C和290Cm位點(diǎn)中，單個(gè)堿基錯(cuò)配

9、使野生基因型樣品TM值從350C降至280C使突變基因型樣品TM值從380C降至270C.根據(jù)理論解鏈曲線，分別于360C380C400C進(jìn)行雜交反應(yīng)。一次加入檢測(cè)探針和AntiDigPOD，使吸附、雜交、酶聯(lián)在發(fā)光管中同時(shí)進(jìn)行，洗滌后加入發(fā)光底物進(jìn)行檢測(cè)，確定400C為適宜雜交溫度。同酶聯(lián)免疫法，我們分析了方法的日內(nèi)及日間變異，檢測(cè)敏感性，并對(duì)8。個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明m，和m位點(diǎn)的檢測(cè)限分別為2.5和。5ng80個(gè)樣品的比值位于

10、三個(gè)互不重疊的區(qū)域內(nèi)，可以嚴(yán)格區(qū)分。2笨并(a)花對(duì)沛建細(xì)造DNA報(bào)傷友修復(fù)森因表達(dá)水平的形響采用1NM和lopm苯并(a)花處理肺癌A549細(xì)胞，分別于處理1224小時(shí)和處理后1224和48小時(shí)提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。RTPCR技術(shù)檢測(cè)NER途徑8個(gè)基因(XPAXPBXPCXPDXPFXPGCSBERCCl)mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明1FM苯并(a)花處理誘導(dǎo)所有8個(gè)NER基因表達(dá)上調(diào)，而lopm苯并(a)花處理下調(diào)8個(gè)NER墓因表