基質(zhì)金屬蛋白酶-3基因啟動子區(qū)多態(tài)與散發(fā)性腦動靜脈畸形的遺傳易感性分析與功能研究.pdf

1、[目的]
　　探索基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinases3，MMP3）基因啟動子區(qū)多態(tài)與散發(fā)性腦動靜脈畸形(Brain arteriovenous malformation，BAVM)的遺傳易感性，并研究MMP基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)的生物學功能。
　　[方法]
　　MMP3是基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metal

2、loproteinases，MMP)家族中的重要成員，具有降解細胞外基質(zhì)的功能，參與血管重塑與再生，可能在BAVM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題首先通過數(shù)據(jù)庫檢索，選擇了5個在中國人群中高頻分布的潛在MMP3基因功能性SNP位點，通過病例-對照進行研究。經(jīng)檢測319例BAVM患者和333例健康對照組的血液標本，確定了與BAVM發(fā)病相關的MMP3基因啟動子區(qū)SNP位點-709A＞G(rs522616)。其次，對該位點A＞G突變降低BAVM

3、發(fā)生風險的分子機制進行了探索。本課題采用構建含有-709A、-709G以及位點突變的pGL3-A、pGL3-G和pGL3-mutant熒光素酶報告載體，分別轉(zhuǎn)染HEK293和HUVEC細胞，檢測熒光素酶活性，分析該SNP位點不同等位基因所導致的MMP3基因轉(zhuǎn)錄活性的不同。再通過添加含有-709A、-709G的競爭性DNA片段，分析pGL3-A受干擾后的轉(zhuǎn)錄活性，比較這兩種等位基因與轉(zhuǎn)錄因子之間結合力的強弱。然后通過生物信息學軟件確定與該

4、MMP基因啟動子區(qū)SNP結合的轉(zhuǎn)錄因子為c-myb，并通過構建其過表達熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染、染色質(zhì)免疫共沉淀和凝膠遷移實驗，檢測c-myb對MMP3基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，并在BAVM組織中進行驗證。
　　[結果]
　　通過分子流行病學調(diào)查，BAVM病例組與對照組在年齡和性別上分別匹配(p=0.062&0.945)，沒有統(tǒng)計學差異。在檢索分析獲得的5個SNP位點中，MMP3基因啟動子區(qū)-709bp SNP位點rs522616

5、A＞G在BAVM病例和對照組中存在顯著差異(P=0.02)，攜帶rs522616 AG雜合基因型的個體與AA基因型攜帶者相比，BAVM的患病風險降低了38％(Adjusted OR=0.62，95％ CI=0.44-0.87，P=0.006)。轉(zhuǎn)錄活性實驗證實，在HEK293細胞中，G等位型的熒光素酶活性較A相比顯著下降了2.67倍(P＜0.01);在HUVEC細胞中，G等位型也下降了5.89倍(P＜0.05)。在競爭實驗中，A比G競爭

6、片段可以更大程度降低pGL3-A轉(zhuǎn)錄的熒光素酶活性(Aportion vs G portion=0.503-fold vs0.756-fold，P=0.01)。提示A＞G的突變降低了MMP3基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性以及與轉(zhuǎn)錄因子的結合力。通過生物信息學檢測，發(fā)現(xiàn)在MMP3基因啟動子區(qū)SNP rs522616周圍6個堿基TTCAAT是轉(zhuǎn)錄因子c-myb的結合位點，在細胞水平上過表達c-myb，可以使得pGL3-A的熒光素酶活性在HEK293

7、及HUVEC細胞中分別提高了1.7倍和1.2倍(P＜0.05)，而不能明顯提高pGL-G的轉(zhuǎn)錄活性。染色質(zhì)免疫共沉淀和凝膠遷移實驗證實了在細胞系以及BAVM組織中，轉(zhuǎn)錄因子c-myb與包含-709A等位型的MMP啟動子區(qū)域結合更為緊密。
　　[結論]
　　本研究首次提出MMP3基因啟動子區(qū)SNP-709 A＞G(rs522616)可能可以降低BAVM的發(fā)病風險，該保護作用的機制在于-709 A＞G的突變能減弱MMP3基因啟動