間硝苯地平同系物的合成及其腸道吸收預(yù)測(cè)研究.pdf

1、目的：以目前國(guó)際公認(rèn)的預(yù)測(cè)藥物腸道吸收的Caco-2細(xì)胞為模型，研究間硝苯地平及其同系物在Caco-2細(xì)胞上的攝取動(dòng)力學(xué)，對(duì)該同系物進(jìn)行腸道吸收篩選，確定出候選藥物，為該類藥物的研發(fā)提供可靠的依據(jù)。 方法：1.采用改進(jìn)的方法合成間硝苯地平及其同系物。在間硝苯地平的合成中采用一步法進(jìn)行合成，應(yīng)用濃氨水作為反應(yīng)中的氨源，進(jìn)一步優(yōu)化合成路線。在MN9202合成中，首先將合成的間硝苯地平在堿性條件下水解而生成中間體，然后利用中間體進(jìn)行酯

2、化反應(yīng)，從而生成MN9202。合成的化合物運(yùn)用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，確定為目標(biāo)化合物并且達(dá)到純度要求。2.采用HPLC方法建立生物樣本中間硝苯地平及其同系物在的檢測(cè)方法。3.培養(yǎng)成熟的Caco-2細(xì)胞分別與100μM的間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育5、10、20、30、40、60min，采用HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，觀察細(xì)胞對(duì)藥物的攝取與時(shí)間之間的關(guān)系。4.培養(yǎng)成熟的Caco-2細(xì)胞分別與50、100、200

3、、500、1000μM間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育一定的時(shí)間，采用HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，觀察細(xì)胞對(duì)藥物的攝取與藥物濃度之間的關(guān)系。5.用不同濃度的P-糖蛋白抑制劑(維拉帕米的濃度為10、25、100μM，環(huán)孢菌素A的濃度為5、20、50μM)與Caco-2細(xì)胞孵育30min，除去抑制劑，加入100μM間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育一定時(shí)間，采用HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，觀察P

4、-糖蛋白抑制劑對(duì)藥物攝取量的影響。 結(jié)果：1.合成的m-Nif、MN9202在選定的流動(dòng)相條件下與對(duì)照品具有相同的出峰時(shí)間且峰形良好，純度大于95％，合成的化合物在237nm和350nm處均具有特征吸收峰。2.由于間硝苯地平及其同系物在237nm處的紫外吸收峰較350nm處強(qiáng)2-3倍，加之細(xì)胞樣品內(nèi)源性干擾少，因此選擇237nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；利用堿化液處理樣品，選用乙醚對(duì)生物樣品中的藥物進(jìn)行提取，降低了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，提高了藥

5、物的提取率以及檢測(cè)的特異性和靈敏度。檢測(cè)m-Nif和MN9201的流動(dòng)相組成為：乙腈/水=75/25，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm；檢測(cè)MN9202和MN9203的流動(dòng)相組成為：乙腈/水=82/18，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm。檢測(cè)m-Nif的工作曲線回歸方程為Y=0.1319+0.0048X(r=0.9998,n=7)，線性范圍為20-1000ng/mL，其低、中、高三個(gè)濃度的日間RSD分別為8.52％、6.

6、70％、8.61％，日內(nèi)RSD為1.55％、2.37％、2.98％(n=7)。檢測(cè)MN9201的工作曲線回歸方程為Y=-0.0085+0.0044X(r=0.9998,n=7)，線性范圍為20-1000ng/mL，其低、中、高三個(gè)濃度的日間RSD分別為6.52％、9.70％、8.61％，日內(nèi)RSD為3.63％、7.45％、10.01％(n=7)。檢測(cè)MN9202的工作曲線回歸方程為Y=0.0592+0.0048X(r=0.9999,n=

7、7)，線性范圍為20-1000ng/mL，其低、中、高三個(gè)濃度的日間RSD分別為10.97％、13.25％、14.23％，日內(nèi)RSD分別為5.09％、7.62％、7.22％(n=7)。檢測(cè)MN9203的工作曲線回歸方程為Y=0.1654+0.0048X(r=0.9996,n=7)，線性范圍為40-1000ng/mL，其低、中、高三個(gè)濃度的日間RSD分別為14.65％、7.88％、9.89％(n=7)，日內(nèi)RSD為9.55％、5.78％、

8、6.01％(n=7)。3.Caco-2細(xì)胞對(duì)間硝苯地平、MN9202、MN9201的攝取，在孵育時(shí)間分別為20、30、40分鐘時(shí)達(dá)到最大，攝取藥物的最大量分別為4250±9、25855±517、47013±623pmoL/mg蛋白；而細(xì)胞對(duì)MN9203的攝取量在孵育60min后仍有上升的趨勢(shì)。4Caco-2細(xì)胞對(duì)間硝苯地平、MN9201、MN9202的攝取在藥物濃度為500uM時(shí)達(dá)到最大，而細(xì)胞對(duì)MN9203的攝取隨著濃度的增加呈增加的

9、趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未見(jiàn)最大值出現(xiàn)。間硝苯地平的最大攝取量為5772±395pmoL/mg蛋白，MN9201達(dá)到的最大攝取量為1539×103±13133pmoL/mg蛋白，MN9202達(dá)到的最大攝取量為7615±83pmoL/mg蛋白。5.不同濃度P-糖蛋白抑制劑對(duì)該類藥物攝取的影響各不相同。P-糖蛋白抑制劑對(duì)間硝苯地平的攝取沒(méi)有明顯的影響。應(yīng)用低、中、高濃度維拉帕米后，細(xì)胞對(duì)MN9201和MN9202的攝取量沒(méi)有顯著的增加(p＞0

10、.05)；低濃度的維拉帕米對(duì)MN9203的攝取量沒(méi)有顯著影響(p＞0.05)，但中濃度和高濃度的維拉帕米可使細(xì)胞對(duì)MN9203的攝取顯著增加(p＜0.05)。用低、中、高三個(gè)濃度的環(huán)孢菌素A處理之后，細(xì)胞對(duì)MN9201的攝取量明顯增加(p＜0.05)；中濃度和高濃度的環(huán)孢菌素A可使細(xì)胞對(duì)MN9202的攝取量顯著增加(p＜0.05)；低濃度的環(huán)孢菌素A處理后，細(xì)胞對(duì)MN9203的攝取呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)，而中濃度和高濃度組對(duì)MN9203的攝

11、取卻沒(méi)有明顯影響(p＞0.05)。應(yīng)用P-糖蛋白抑制劑之后，除間硝苯地平外，細(xì)胞對(duì)MN9201、MN9202、MN9203的攝取量有不同程度的增加。 結(jié)論：1.改良之后的合成路線能夠合成出具有較高純度的間硝苯地平及MN9202同系物，且縮短了反應(yīng)時(shí)間。2.本文建立的生物樣品中二氫吡啶類藥物的HPLC檢測(cè)方法，具有準(zhǔn)確、靈敏、可靠、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。3.Caco-2細(xì)胞對(duì)間硝苯地平同系物的攝取存在時(shí)間依賴、濃度依賴關(guān)系。四種藥物中，細(xì)胞