柑橘果肉有色體的結(jié)構(gòu)特征及其分化研究.pdf

1、色澤品質(zhì)是果實品質(zhì)構(gòu)成的關(guān)鍵因素，直接決定了果實的商品價值。類胡蘿卜素是人類生活中必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)之一，這些類胡蘿卜素合成并儲存于有色體中，同時有色體也是其他一些重要的次生代謝物和激素（如生育酚和茉莉酸等）的合成和儲存器官。因此，研究柑橘果實有色體的結(jié)構(gòu)及其分化機理具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本研究采用6個柑橘品種，利用細胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)等手段研究了柑橘果肉有色體的結(jié)構(gòu)、分化及其機理。主要結(jié)果如下:
　　1、柑

2、橘果肉有色體的結(jié)構(gòu)、分化及其分子調(diào)控機理初探
　　采用光學(xué)和電子顯微鏡比較分析3對紅肉和黃肉柑橘品種的有色體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合高效液相色譜測量的有色體類胡蘿卜素的含量與組分數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)紅肉品種的紅肉組織以積累番茄紅素或β-胡蘿卜素為主，最終形成晶狀有色體;而(2)黃肉品種的黃肉組織以積累葉黃素和β-紫黃質(zhì)為主，最終形成球狀有色體。與黃肉野生型材料相比，兩對甜橙紅肉突變材料[Citrus sinensis(L.) Osbeck]

3、的色澤差異主要來自囊衣和汁胞壁，而其汁胞液所含的有色體類型及其色素組成與野生型保持一致。進而對不同發(fā)育時期的紅暗柳果實的汁胞壁和汁胞液進行細致的細胞學(xué)觀察，結(jié)合類胡蘿卜素測定及Western雜交實驗，結(jié)果表明柑橘果肉的有色體是由淀粉體分化而來，而非像果皮那樣由葉綠體分化而來。最后，對類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因進行實時定量PCR分析，結(jié)果表明類胡蘿卜素合成和貯存基因顯著上調(diào)表達，尤其是β-胡蘿卜素羥化酶(HYD)的大量表達，而類胡蘿卜素降解雙

4、氧酶4a(CCD4a)基因明顯下調(diào)表達，這些均參與β-紫黃質(zhì)和葉黃素的積累，從而調(diào)控球狀有色體的分化過程。與球狀有色體的分化不同，CCD4b基因在晶狀有色體分化過程中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)表達，暗示著該基因可能在晶狀有色體的形成過程中起著重要作用。與柑橘果皮有色體分化方式不同，柑橘果肉從淀粉體向有色體的分化模式為我們今后研究有色體分化提供了很好的材料和方向。然而，對于有色體的分化機理的研究還有待進一步挖掘。
　　2、利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研

5、究柑橘果肉有色體分化的可能機理
　　(1)首先，以Nycodenz為梯度分離液，經(jīng)過三次不連續(xù)密度梯度離心，從成熟期的紅暗柳果肉中分離出高純度的有色體。光學(xué)和電子顯微鏡觀察結(jié)果表明:分離的有色體保持良好的完整性，屬于內(nèi)含大量質(zhì)體小球的有色體，其直徑大小為2-4μm。采用亞細胞器（胞質(zhì)、線粒體及液泡）的標記抗體，Western雜交實驗證明分離的有色體沒有以上三種亞細胞器的污染，表明分離的有色體具有很高的純度。從提純的有色體中提取總蛋

6、白，經(jīng)過酶解后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，共鑒定到493個有色體候選蛋白，其中418個是高可信度的有色體蛋白（包括89個柑橘特有的新蛋白）。功能分類表明，這418個有色體定位蛋白主要參與以下6大類代謝途徑:①碳水化合物代謝;②氨基酸代謝;③蛋白調(diào)控與轉(zhuǎn)運;④類胡蘿卜素代謝;⑤脂類代謝;⑥氧化逆境相關(guān)蛋白。值得注意的是，HDS（羥甲基丁烯基-4-磷酸合成酶），PAP（質(zhì)體脂相關(guān)蛋白）和psHSPs（質(zhì)體小熱激蛋白）是最高豐度蛋白，主要參與類胡蘿卜素

7、的合成與儲存以及逆境脅迫等代謝途徑。與呼吸躍變型的番茄果實的有色體蛋白譜相比，兩者的大多數(shù)蛋白為與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、次生代謝、逆境及蛋白調(diào)控與轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白;但是，柑橘有色體有著更完善的類胡蘿卜素合成途徑，更廣泛的氨基酸合成途徑以及完整的脂類代謝特別是茉莉酸合成途徑?？紤]到質(zhì)體定位的小熱激蛋白21(psHSP21)在柑橘有色體總蛋白中占著極高的比重，推測該蛋白可能在柑橘發(fā)育中起著特殊且重要的作用。總之，本文首次建立柑橘果肉有色

8、體的提純方法，并且從蛋白水平上揭示柑橘有色體代謝活動的保守性和獨特性。
　　(2)比較蛋白質(zhì)組學(xué)解析柑橘果實成熟和衰老過程中的有色體分化的蛋白動態(tài)變化
　　柑橘果肉的成熟過程伴隨著淀粉體向典型有色體的轉(zhuǎn)化過程。該過程主要特點為:淀粉粒逐漸降解而質(zhì)體小球數(shù)量顯著增多，同時整個質(zhì)體的內(nèi)膜系統(tǒng)有著復(fù)雜的重排過程。我們采用基于iTRAQ的比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究柑橘有色體分化過程中的蛋白動態(tài)變化以解析柑橘果實在綠熟期、破色期、成熟期

9、和過熟期中的質(zhì)體結(jié)構(gòu)重排過程。經(jīng)嚴格的生物信息學(xué)分析，一共鑒定到1905個蛋白，其中1386個為質(zhì)體候選蛋白，其中又有1016個蛋白具有iTRAQ值。采用5個來自不同代謝途徑的抗體，Western雜交實驗表明iTRAQ值與真實的蛋白豐度變化相符，證明該數(shù)據(jù)具有很好的可靠性。從淀粉體向有色體轉(zhuǎn)化過程中主要有以下變化:(a)參與質(zhì)體小球形成、類胡蘿卜代謝和蛋白降解的相關(guān)蛋白的蛋白豐度顯著增加;(b)參與蛋白合成相關(guān)蛋白的蛋白豐度顯著下調(diào);(

10、c)參與信號、細胞和DNA&RNA相關(guān)蛋白的蛋白豐度則保持相對穩(wěn)定。特別值得注意的是，質(zhì)體蛋白運輸穩(wěn)定，質(zhì)體翻譯機制與組裝活性顯著降低及蛋白酶體降解機制普遍上升，這些變化表明了它們可能在有色體內(nèi)膜重塑過程中起著關(guān)鍵的重要作用。另外，本研究首次評價了有色體衰老過程中質(zhì)體蛋白的變化，蛋白豐度顯著上調(diào)的蛋白主要為參與氧化逆境脅迫、細胞、電子傳遞、轉(zhuǎn)運及TCA/org途徑相關(guān)的蛋白;蛋白豐度顯著下調(diào)的蛋白主要為參與蛋白合成、主CHO代謝以及輔助

11、因子和維他命代謝途徑相關(guān)的蛋白;而質(zhì)體小球定位蛋白的蛋白豐度則變化不明顯?？偟脕碚f，本研究從蛋白水平上揭示了淀粉體向有色體（異養(yǎng)型質(zhì)體之間）分化過程的蛋白動態(tài)變化及有色體衰老過程的蛋白變化，為今后研究柑橘果實發(fā)育提供了寶貴的線索。
　　3、ABC1K激酶家族的功能初探
　　(1)比較蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)CitABCK1、3、7和9隨著有色體的發(fā)育其蛋白豐度顯著上升。進一步的亞細胞定位實驗表明CitABCK1、3和9定位于質(zhì)體的質(zhì)

12、體小球中。我們構(gòu)建ABCK1、3和9基因的超量和沉默相關(guān)載體，并穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化到柑橘愈傷、番茄和擬南芥中進行相關(guān)功能研究。相關(guān)實驗正在進行中。
　　(2)柑橘有色體及質(zhì)體小球磷酸化蛋白質(zhì)的深度挖掘。由于ABC1K屬于定位于質(zhì)體中的激酶，為了尋找可能的磷酸化修飾底物，我們對柑橘果肉有色體進行磷酸化蛋白質(zhì)組分析。與其他質(zhì)體類型一樣，有色體具有重要的合成與代謝活性，而這些活性往往受到翻譯后修飾，特別是蛋白質(zhì)磷酸化修飾調(diào)控。因此，從未成熟期

13、、破色期和成熟期的紅暗柳橙果肉中提純質(zhì)體，并提取其中的總蛋白，采用TiO2法富集磷酸化蛋白，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)鑒定，共鑒定到109個質(zhì)體磷酸化蛋白，包括179個唯一的磷酸化位點和135個唯一的磷酸化肽段。根據(jù)Motif-Ⅹ（激酶模式抽提軟件）分析，共得到兩類磷酸化位點修飾模式，一類為脯氨酸導(dǎo)向磷酸模式，另一類為酪蛋白激酶Ⅱ模式。通過與磷酸化蛋白數(shù)據(jù)庫(PhosPhAt和P3DB)的比對，發(fā)現(xiàn)約22％的磷酸化蛋白屬于新鑒定到的磷酸化蛋