枯草芽孢桿菌B-332菌株發(fā)酵條件及其抗菌物質分離純化的研究.pdf

1、稻瘟病是全世界稻區(qū)危害最嚴重的水稻病害之一,每年對世界水稻產(chǎn)量的影響高達30﹪,現(xiàn)有防治稻瘟病的手段多以抗性植株和化學農(nóng)藥為主,化學農(nóng)藥會造成環(huán)境的污染及生態(tài)平衡的破壞,生物農(nóng)藥具有安全、無毒副作用、不污染環(huán)境等優(yōu)點,大力發(fā)展生物農(nóng)藥已成為必然的趨勢.因此,對水稻稻瘟病的植病生防領域研究具有重要的現(xiàn)實意義.本研究以枯草芽孢桿菌B-332菌株為實驗材料,通過摸索該菌株搖瓶發(fā)酵工藝的技術和數(shù)據(jù),確定該菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件,為該菌株

2、的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎;此外,分離純化和獲得各分離的組分,測定它們質譜圖及抗菌活性,對解析分離各組分對稻瘟病菌抑制的作用機理,揭示該菌株該菌株對稻瘟病菌防治的深層原因具有十分重要的意義. 1.將芽孢數(shù)量作為評價發(fā)酵工藝的主要標準,抗菌粗提物含量作為輔助標準.采用結晶紫染色法和平板傾注法相結合的方法測量發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量,用紫外分光光度計法測量發(fā)酵液中抗菌粗提物的含量.明確了發(fā)酵液中抗菌粗提物的濃度與其在272.9nm波長下的吸收值

3、之間的線性關系,標準方程為y=0.06x+0.153, R<'2>為0.9994,擬和效果較好. 2.對枯草芽孢桿菌B-332菌株搖瓶發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,確定正交優(yōu)化后的培養(yǎng)基主要成分為:豆餅粉6.0﹪、蔗糖2.5﹪、硫酸銨0.7﹪、檸檬酸三鈉0.3﹪等;培養(yǎng)條件方面,確定種齡為18h、接種量為10﹪,對裝量、溫度和轉速等條件優(yōu)化后確定裝量80mL/500mL、溫度30℃、轉速180r/min.基本明確了該綜合條件下發(fā)酵過程的參

4、數(shù)變化規(guī)律,發(fā)酵周期終點為 72h,此時芽孢數(shù)為 1.43×10<'11>cfu/mL,比出始條件的4.03×10<'9>cfu/mL 提高了 34.48 倍,抗菌粗提物含量達到213.82mg/mL. 3.等電點法提取該抗菌粗提物,即對該菌株發(fā)酵液離心后,將其pH值調至4.0,抗菌粗提物可以完全沉淀出來,抗菌粗提物經(jīng)過高效液相色譜-質聯(lián)用儀的分離純化,得到5個組分,按照出峰時間順序,它們的荷質比(m/z)分別為1045.0、1

5、057.8、1072.3、1017.5和1031.1,預測4個組分的結構(荷質比(m/z)為1017.5的除外),依次為Bacillomycin D(iso-C15)、BacillomycinD(50﹪-iso-C16)或Bacillomycin D(50﹪-n-C16)、Bacillomycin D(ante-iso-C17)及Bacillomycin D(n-c14),它們結構間的區(qū)別在于相差1個或幾個-CH<,2>-基團;各組分均