不結(jié)球白菜BcRISP1的功能分析.pdf

1、細胞質(zhì)雄性不育系作為雜交育種的重要材料，其分子機理的研究對花粉發(fā)育及細胞質(zhì)遺傳等問題的探究具有重要作用。細胞色素C還原酶鐵硫蛋白(RISP)是線粒體電子傳遞鏈多酶復(fù)合物的一個亞基，它催化電子從輔酶Q傳給細胞色素C。RISP在線粒體呼吸鏈中的作用是完全必要的，其為線粒體產(chǎn)生能量用于生物體各項生命活動提供重要保障。對不結(jié)球白菜BcRISP1基因的功能研究有助于進一步了解不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育發(fā)生的機理。本實驗利用不結(jié)球白菜差減雜交庫分析不育

2、系與保持系的差異，發(fā)現(xiàn)細胞色素C還原酶鐵硫蛋白基因BcRISP1在不育系和保持系中的表達有差異，于是設(shè)計引物，克隆獲得BcRISP1基因全長。通過酵母雙雜交篩選互作基因并驗證，亞細胞定位及轉(zhuǎn)基因驗證，明確了BcRISP1基因的表達與不結(jié)球白菜雄性不育的相關(guān)性。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.從不結(jié)球白菜抑制消減cDNA文庫中克隆出一條BcRISP1基因，是細胞色素C還原酶鐵硫蛋白家族的成員之一。BcRISP1序列全長810

3、 bp，編碼269個氨基酸，同時含有一個細胞色素C還原酶跨膜域(Ala77-Asp141)和一個Rieske[2Fe-2S](Val170-Lys266)結(jié)構(gòu)域。通過氨基酸比對，發(fā)現(xiàn)其與其他物種的RISP家族具有很高的同源性。熒光定量PCR表明BcRISP1基因在不育系花蕾的孢原細胞階段高表達。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)BcRISP1主要定位在細胞膜和細胞核上。因此，推測BcRISP1在Pol CMS不育系中可能起一定的作用。
　　2.利用G

4、ateway技術(shù)構(gòu)建了植物過量表達載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染擬南芥，篩選陽性苗進行功能分析。表型分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的種子數(shù)減少，種莢數(shù)及種莢的大小也小于野生型擬南芥。實時定量PCR發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈相關(guān)基因COX10和RIP1表達量上調(diào)，而QCR7和SDH2-1基因表達量下降。同時BcRISP1基因過表達會減少花粉的形成并抑制花粉管的萌發(fā)。這就表明BcRISP1基因的過表達會影響轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的育性。
　　3.從不結(jié)球白菜Pol胞

5、質(zhì)雄性不育花中提取總RNA，通過長距離PCR，擴增雙鏈cDNA(ds cDNA)。利用SMART技術(shù)，通過同源重組的方法，在酵母菌株Y187中構(gòu)建了不結(jié)球白菜Pol胞質(zhì)雄性不育花的全長cDNA文庫。經(jīng)檢測，文庫的轉(zhuǎn)化率為1.80×106轉(zhuǎn)化子/3μg pGADT7-Rec，文庫滴度為1.21×107 cfμ/mL，重組率為94％。利用酵母雙雜技術(shù)，篩選出與BcRISP1基因互作的基因CYP81G和PIP2。通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化和熒光雙分子互補