肌腱細胞體外牽伸模型建立及不同牽伸負荷對其炎癥介質產(chǎn)生的影響.pdf

1、研究背景：
　　 肌腱病(tendinopathy)是骨科學、運動醫(yī)學和職業(yè)病醫(yī)學的常見病之一。普遍認為肌腱病與肌腱的過度使用(overuse)直接有關,但其發(fā)病機制尚不明確。肌腱病發(fā)病機制目前主要存在兩種截然相反的觀點:炎癥介質學說和肌腱退變學說。支持炎癥介質學說的學者認為肌腱在過度使用后首先產(chǎn)生炎癥介質,炎癥介質導致肌腱組織變性,從而引起肌腱病;而支持肌腱退變學說的學者持反對意見,認為肌腱病中無炎癥介質參與,肌腱病是由肌腱退

2、行性病變引起。本研究擬探討肌腱細胞在過度牽伸載荷下是否產(chǎn)生炎癥介質。
　　 由于體內環(huán)境的復雜性及倫理學相關問題,直接在體內觀察肌腱組織細胞對機械應力刺激的反應及其機理比較困難,主要依賴體外細胞牽拉裝置機械牽拉體外肌腱細胞以研究肌腱細胞在過度牽拉下是否有炎癥介質產(chǎn)生。但目前體外細胞牽拉裝置存在以下不足:1.對牽拉的強度及頻率控制范圍窄,自動化程度低,需要人工調節(jié);2.應力的施加模式單一,對所有需要牽拉的細胞實行單一牽拉模式,不能

3、有效的反應不同細胞在不同牽拉情況下的反應;3.不能較好的模擬體內細胞排列方向及受力方式進行牽拉,影響研究結果。
　　 研究目的：
　　 根據(jù)體內肌腱細胞排列方向及受力方式,研制一種新型肌腱細胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng),建立體外肌腱細胞過度牽拉模型并予以測試。通過測定過度牽拉負荷下人肌腱細胞產(chǎn)生的炎性介質:前列腺素E2(PGE2)、白介素1β(IL-1β)和環(huán)氧化酶2(COX-2)的變化,明確炎癥介質在肌腱病發(fā)病中的作用。為肌腱病

4、研究提供理想的細胞牽拉模型及重要的實驗依據(jù)。
　　 方法
　　 1.用聚二甲基硅氧烷預聚物(PDMS)與固化劑以10:1(體積比)制備微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿。對微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿進行超大負荷牽拉,牽拉幅度達12％,頻率2.0Hz,時間24小時,觀察培養(yǎng)皿抗牽拉情況;培養(yǎng)皿表面滴加提高細胞黏附的纖維結合素連接蛋白(ProNectin-F)后將人肌腱細胞接種于培養(yǎng)皿上,普通培養(yǎng)皿上接種人肌腱細胞作為對照組,倒置光顯微鏡對比觀察細

5、胞形態(tài)、存活情況及排列情況;計數(shù)貼壁存活細胞數(shù)和接種細胞數(shù)計算細胞貼壁率;
　　 2.利用步進電機帶動的機械力對微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿進行單軸動力牽拉,可編程控制器配控制循環(huán)載荷牽伸裝置的運轉速度及時間,調節(jié)對培養(yǎng)皿的牽拉頻率和時間;更換不同大小凸輪對培養(yǎng)皿實行不同牽拉強度。檢測對新型肌腱細胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)的機械性能及穩(wěn)定性;初步觀察肌腱細胞在循環(huán)牽伸載荷下生物學表現(xiàn);
　　 3.新型肌腱細胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)對體外培養(yǎng)人肌

6、腱細胞進行不同強度及頻率的牽拉。設定牽拉頻率0.5Hz,牽拉時間12小時,牽拉后培養(yǎng)24小時,根據(jù)不同牽拉強度設4％,8％,12％牽拉組,非牽拉組作空白對照,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測不同牽拉強度下前列腺素E2(PGE2)和白介素1β(IL-1β)變化;設定牽拉強度8％,牽拉時間12小時,牽拉后培養(yǎng)24小時,根據(jù)不同牽拉頻率設0.5Hz,1.0Hz,1.5Hz牽拉組,非牽拉組作空白對照,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測

7、不同牽拉頻率下前列腺素E2(PGE2)和白介素1β(IL-1β)變化;設定牽拉頻率0.5Hz,牽拉時間4小時,牽拉后培養(yǎng)4小時,根據(jù)不同牽拉強度設4％,8％,12％牽拉組,非牽拉組作空白對照,蛋白質印跡技術(Westem blot)檢測不同牽拉強度下人肌腱細胞COX-2蛋白質表達。
　　 結果：
　　 1.微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿參數(shù):微槽寬和槽間橋寬均為10μm,槽深3μm,培養(yǎng)皿表面積為3cm×6cm。微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿在

8、超大負荷下牽拉下無斷裂及撕裂,彈性良好;微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿上肌腱細胞生長及貼壁良好,細胞呈平行排列,與體內肌腱細胞排列方向類似,而光滑面培養(yǎng)上肌腱細胞排列雜亂無章;肌腱細胞在微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿和普通培養(yǎng)皿上細胞貼壁率無明顯差別;
　　 2.新型肌腱細胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)通過更換不同凸輪大小,能實現(xiàn)不同牽拉強度2％,4％,8％,12％控制;電子控制頻率可調節(jié)范圍為:0.1-2Hz,可調節(jié)量為:0.1Hz,時間可調節(jié)范圍為0-24小時

9、,可調節(jié)量為:1分鐘;該系統(tǒng)能按預定的強度、頻率及時間對微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿進行牽拉,運行良好且穩(wěn)定;
　　 3.牽拉頻率0.5Hz,牽拉時間12小時,4％牽拉組,8％牽拉組,12％牽拉組,非牽拉組PGEz量分別為:499.97±73.71pg/萬個細胞,559.11±55.89pg/萬個細胞,1132.84±42.24Pg/萬個細胞,1507.72±40.86 pg/萬個細胞,IL-1β濃度分別為:6.35±0.64pg/ml,

10、7.52±0.66pg/ml,8.88±1.21pg/ml,16.64±3.25pg/ml,經(jīng)統(tǒng)計學分析,PGE2在8％和12％牽拉強度時明顯增加(P＜0.05);而IL-1β在12％牽拉強度下明顯增高(P＜0.05)。牽拉強度8％,牽拉時間12小時,0.5Hz牽拉組,1.0Hz牽拉組,1.5Hz牽拉組,非牽拉組PGE2量分別為:645.31±24.76pg/萬個細胞,1038.162±42.41pg/萬個細胞,1649.06±265.

11、30pg/萬個細胞,1756.70±250.68pg/萬個細胞,IL-1β濃度分別為:6.88±1.91pg/ml,9.54±0.15pg/ml,13.80±3.63pg/ml,15.88±3.5pg/ml,經(jīng)統(tǒng)計學分析,PGE2產(chǎn)生的量,0.5Hz牽拉組,1.0Hz牽拉組,1.5Hz牽拉組與非牽拉組相比明顯增高,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而IL-1β在1.5Hz牽拉頻率下比非牽拉組明顯增高(P＜0.05)。人肌腱細胞COX-2蛋白

12、表達情況:4％、8％、12％牽拉組灰度值逐漸增加,與非牽拉組有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1.微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿彈性良好,能滿足不同牽拉強度、頻率和時間的需要,培養(yǎng)皿經(jīng)消毒后可以反復使用;微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿上人肌腱細胞生長及貼壁生長良好,肌腱細胞呈平行排列,與體內類似;
　　 2.新型肌腱細胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)是一個好的體外肌腱細胞牽伸載荷模型,具有運行穩(wěn)定,可控性強等特點;
　　 3