角膜內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型的建立.pdf

1、目的：從角膜內(nèi)皮細胞的分離、培養(yǎng)基的選擇、細胞培養(yǎng)方式及種屬來源方面進行篩選和優(yōu)化，尋找最佳的角膜內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型的建立方法，為以后角膜內(nèi)皮細胞在體外的長期有效培養(yǎng)提供實驗依據(jù)。
　　方法：本實驗分為四個部分，通過對四個部分結果的綜合分析得出角膜內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)模型。①剝離帶后彈力層的兔角膜內(nèi)皮片，用雙酶消化法（胰蛋白酶和膠原酶）及組織片法對角膜內(nèi)皮細胞進行分離培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細胞生長情況，經(jīng)觀察分析得出的細胞

2、數(shù)量多、污染少的較好分離方法，為后續(xù)階段采用。②選取F99培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、KSFM培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基分別對兔角膜內(nèi)皮細胞進行原代及傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細胞生長情況。經(jīng)分析討論得出細胞增殖快、細胞形態(tài)好的培養(yǎng)基，后續(xù)階段沿用。③采用消化法、與3T3細胞共培養(yǎng)法、細胞克隆培養(yǎng)法對兔角膜內(nèi)皮細胞進行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細胞生長情況，得出細胞傳代快、傳代較久的培養(yǎng)方法。④對人、豬、小鼠、兔角膜內(nèi)皮細胞進行體

3、外培養(yǎng)，并進行細胞形態(tài)學觀察及免疫熒光鑒定，選出細胞形態(tài)維持好、傳代時間長的一種角膜內(nèi)皮細胞。
　　結果：①經(jīng)雙酶消化法培養(yǎng)20天后，兔角膜內(nèi)皮細胞呈多邊形或多角星形，細胞形成單層，未見長梭形的兔角膜基質細胞。組織片法培養(yǎng)2周后可見及部分呈長梭型放射狀生長的兔角膜基質細胞生長其中。②F99培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原代兔角膜內(nèi)皮細胞在第25天融合成單層，細胞呈多角形、細胞數(shù)量多，在三種培養(yǎng)基中細胞形態(tài)最規(guī)則，細胞數(shù)目最多，融合時間最快。第2次

4、傳代的第4天，F(xiàn)99培養(yǎng)基培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細胞數(shù)最多，且形態(tài)規(guī)則。③消化法中經(jīng)消化后細胞貼附快，細胞形態(tài)好，消化傳代后，細胞培養(yǎng)4-5天即形成新的單層細胞，在傳至第10代后仍維持較好的生長態(tài)勢。而兔角膜內(nèi)皮細胞與3T3細胞共培養(yǎng)后，第5天可見明顯的兔角膜內(nèi)皮細胞團，細胞呈密集的“鵝卵石”樣形態(tài)。培養(yǎng)至第14天細胞團內(nèi)細胞數(shù)明顯減少，剩余的細胞呈細胞核體積增大、顏色加深的衰老跡象?？寺∨囵B(yǎng)法中角膜內(nèi)皮細胞在培養(yǎng)7天后形成克隆球，擴大培養(yǎng)2

5、代后細胞體積變大，增殖緩慢。④小鼠角膜內(nèi)皮細胞在體外傳代26代后仍維持較好的細胞形態(tài)。兔角膜內(nèi)皮細胞在體外培養(yǎng)26代后增殖減緩，細胞呈長梭形改變，經(jīng)免疫熒光鑒定，此時兔角膜內(nèi)皮細胞已向間質細胞分化。人角膜內(nèi)皮細胞在體外培養(yǎng)從傳代的第4代起細胞不再呈“鋪路石”樣，細胞出現(xiàn)體積增大等衰老狀態(tài)；豬角膜內(nèi)皮細胞在體外培養(yǎng)傳代至第7代細胞停止增殖。
　　結論：利用雙酶消化法分離出小鼠角膜內(nèi)皮細胞在F99培養(yǎng)基中進行消化法培養(yǎng)是角膜內(nèi)皮細胞體