人角膜內(nèi)皮細胞體外增殖的影響因素、分子機理及其激活途徑研究.pdf

1、現(xiàn)有研究結果顯示，成年后已喪失增殖能力的HCE細胞雖然被拘留在細胞周期的G1期，但仍保留有激活后恢復增殖的潛能。許多研究證實，接觸抑制和TGF-β2是體內(nèi)抑制HCE細胞增殖的主要原因，解除其接觸抑制狀態(tài)和加入TGF-β2抑制劑能夠刺激HCE細胞重新恢復增殖能力，但其具體作用效果和分子機理仍有待于進一步研究。除眼睛內(nèi)部的影響因素以外，太陽光中的紫外線(UV)也會對HCE細胞造成一定的氧化損傷作用，很可能也是導致HCE細胞增殖能力下降和逐年

2、死亡的原因之一，但其損傷作用強度和分子機理至今仍不清楚。因此，急需研究和揭示接觸抑制、TGF-β2及UV氧化損傷對HCE細胞增殖能力的具體影響作用及其分子機理，但遺憾的是，由于缺少HCE細胞的體外研究模型，致使無法開展這些研究。
　　本文以我們業(yè)已建立的非轉染HCE細胞系作為體外研究模型，研究接觸抑制、不同濃度TGF-β2及UV氧化損傷對HCE細胞增殖能力的影響作用及其分子機理，并先后采用EDTA聯(lián)合Rho激酶抑制劑Y-27632

3、解除接觸抑制，利用Smad抑制劑SB431542阻斷TGF-β2的信號傳導，以及使用抗氧化保護劑抗壞血酸-2-磷酸酯(Asc-2P)使細胞免受UV氧化損傷，旨在揭示HCE細胞增殖抑制的分子機理以及恢復增殖的有效途徑或方法。
　　為了揭示接觸抑制對HCE細胞增殖抑制作用的分子機理以及解除接觸抑制對HCE細胞增殖能力的恢復作用，本文首先利用第70代非轉染HCE細胞體外培養(yǎng)5天建立了HCE細胞的接觸抑制模型，進而利用該模型研究了EDTA

4、解除接觸抑制對HCE細胞增殖能力的恢復作用，以及Rho激酶抑制劑Y-27632對EDTA處理HCE細胞形態(tài)和功能的保護作用。對接觸抑制形成前后HCE細胞增殖能力的EdU檢測結果顯示，HCE細胞的增殖數(shù)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而逐漸減少，并在第5天形成接觸抑制后全部停止增殖，且在光鏡下形成連續(xù)的匯合單層，表明體外培養(yǎng)第5天所形成的匯合單層HCE細胞可以作為接觸抑制模型用于后續(xù)實驗研究。EDTA處理HCE細胞的光鏡檢測結果顯示，0.2～2 mg

5、/ml EDTA能夠濃度依賴性的導致細胞收縮變圓甚至脫落，并在恢復過程中發(fā)生成纖維樣轉變;細胞骨架免疫熒光染色結果證實，0.2～2 mg/ml EDTA能夠使HCE細胞中肌動蛋白絲和微管的熒光強度顯著增加、長度明顯變長，細胞形態(tài)發(fā)生成纖維樣轉變，并且具有濃度依賴性;EdU滲入檢測結果顯示，0.2～2 mg/ml EDTA能夠顯著促進HCE的增殖（P＜0.01）;細胞功能蛋白的免疫熒光結果顯示，0.2 mg/ml EDTA能夠使ZO-1、

6、Na+/K+-ATPase和N-Cadherin的表達大量減少并發(fā)生定位改變;Western blot結果顯示，EDTA解除接觸抑制后，HCE細胞中ROCK1表達量顯著增加，p27Kip1、p21Cip1和p16INK4a表達量顯著減少（P＜0.01）。以上結果表明，EDTA雖然可以解除HCE細胞接觸抑制并使其恢復增殖，但會導致細胞脫落及形態(tài)和功能改變。Y-27632處理HCE細胞的光鏡觀察和生長曲線檢測結果發(fā)現(xiàn)，5～10μMY-276

7、32能夠濃度依賴性地促進HCE細胞的貼壁和伸展，縮短HCE細胞的遲緩期、延長平臺期并推遲衰退期。EDTA聯(lián)合Y-27632處理HCE匯合單層的檢測結果顯示，5～10μMY-27632能夠濃度依賴性地防止HCE細胞由EDTA處理所引起的脫落，促進EDTA處理后HCE細胞增殖能力的恢復(P＜0.01)，并在HCE細胞的恢復過程中維持其多邊形形態(tài)和功能蛋白的正常表達和定位，同時，Y-27632還能夠顯著抑制HCE細胞中ROCK1、p27Kip

8、1、p21Cip1和p16INK4a的表達(P＜0.01)。這表明，Y-27632能夠抑制細胞分離所導致的脫落，維持HCE正常的形態(tài)結構及生理功能并延緩HCE細胞衰退。以上結果表明，ROCK1和p27Kip1參與了HCE細胞接觸抑制的調(diào)控，Y-27632聯(lián)合EDTA能夠安全有效的解除HCE細胞的接觸抑制，使HCE細胞恢復增殖能力，并延緩HCE細胞衰退。
　　為了揭示TGF-β2對HCE細胞增殖抑制作用的分子機理并探討通過阻斷TGF

9、-β2的信號傳導通路使HCE細胞恢復增殖的可行性。本文首先確定了TGF-β2對體外培養(yǎng)的非轉染HCE細胞的增殖抑制作用，進而研究了TGF-β2信號通路抑制劑對HCE細胞增殖能力的恢復作用。TGF-β2處理HCE細胞的MTT檢測結果顯示，TGF-β2在濃度大于0.2 ng/ml時對HCE細胞活力具有顯著的抑制作用(P＜0.05)，而EdU滲入結果也證實，0.2 ng/ml TGF-β2能顯著抑制HCE細胞增殖（P＜0.05）。 Smad抑

10、制劑SB431542和p38MAPK抑制劑SB203580與TGF-β2聯(lián)合處理HCE細胞的EdU滲入結果顯示，SB431542在濃度高于50 nM時能夠顯著解除0.2 ng/ml TGF-β2對HCE細胞增殖的抑制作用（P＜0.05），而SB203580對TGF-β2的HCE細胞增殖抑制沒有顯著影響;Western blot檢測結果顯示，TGF-β2能夠顯著上調(diào)Smad2和Smad3的表達(P＜0.05)及其磷酸化(P＜0.01)，顯

11、著上調(diào)Smad7(P＜0.05)、p27Kip1和p21Cip1的表達（P＜0.01），SB431542能夠顯著抑制Smad2和Smad3的表達及磷酸化(P＜0.01)，并顯著抑制Smad7(P＜0.05)、p27Kip1和p21Cip1的表達(P＜0.01)。以上結果表明，p27Kip1和p21Cip1參與了TGF-β2對HCE細胞增殖抑制的調(diào)控，TGF-β2對HCE細胞的增殖抑制作用是通過Smad通路介導的，SB431542能夠解除

12、TGF-β2對HCE細胞的增殖抑制作用。
　　為了揭示UVB氧化損傷導致HCE細胞增殖能力下降的分子機理并探討通過抗氧化保護劑降低UVB氧化損傷使HCE細胞恢復增殖能力的可行性，本文首先利用體外培養(yǎng)的非轉染HCE細胞建立了UVB氧化損傷模型，進而利用該模型研究了抗氧化保護劑對HCE細胞氧化損傷的保護作用及增殖能力的恢復作用。UVB照射HCE細胞的光鏡觀察結果顯示，12.5～800 mj/cm2 UVB能夠抑制HCE細胞生長分裂，誘

13、導HCE細胞發(fā)生皺縮、變圓甚至脫落，且具有輻射劑量和時間依賴性，當UVB輻射劑量大于200mj/cm2，照射時間超過12 h時能夠誘導HCE細胞發(fā)生不可逆損傷;MTT檢測結果顯示，UVB能夠輻射劑量和時間依賴性的使HCE細胞活力顯著下降(P＜0.01)，這表明，UVB能夠誘導HCE細胞發(fā)生損傷，降低HCE細胞的增殖能力。200mj/cm2和400 mj/cm2 UVB照射處理HCE細胞的8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)免疫熒光染色結果顯

14、示，UVB能夠顯著誘導HCE細胞發(fā)生DNA氧化損傷（P＜0.01），且主要發(fā)生在核DNA;二氫乙啶(DHE)染色觀察結果發(fā)現(xiàn)，UVB能夠顯著提高HCE細胞內(nèi)的ROS水平（P＜0.01），具有輻射劑量和時間依賴性，并且ROS能夠在HCE細胞內(nèi)發(fā)生積累;Western blot檢測結果顯示，UVB能夠顯著上調(diào)HCE細胞中p53和p21Cip1的表達及p53的磷酸化(P＜0.01)。由此可見，UVB對HCE細胞的氧化損傷是通過誘導ROS的產(chǎn)生

15、來實現(xiàn)的，進而通過上調(diào)p53和p21Cip1的表達抑制HCE細胞的增殖。抗氧化保護劑黃酮(Flavone)、原花青素(PC)、抗壞血酸(Asc)和抗壞血酸-2-磷酸(Asc-2P)處理HCE細胞的MTT結果顯示，Asc-2P對HCE細胞沒有毒副作用且能使HCE細胞活力顯著提高(P＜0.01)，提高HCE細胞活力的有效濃度為1.5 mM。對Asc-2P預處理后經(jīng)UVB照射處理的HCE細胞的檢測結果顯示，Asc-2P能夠減少HCE細胞的脫落

16、和死亡、促進HCE細胞形態(tài)和生長的恢復、顯著降低DNA的氧化損傷(P＜0.01)和細胞中的ROS水平(P＜0.01)，并顯著下調(diào)UVB誘導的p53和p21Cip1的表達以及p53的磷酸化(P＜0.01)。上述結果表明，UVB能夠誘導HCE細胞產(chǎn)生ROS，從而引起HCE細胞DNA的氧化損傷，并通過上調(diào)p53和p21Cip1的表達抑制HCE細胞增殖，而Asc-2P能夠降低UVB照射HCE細胞的ROS水平，減少HCE細胞DNA氧化損傷，下調(diào)p

17、53和p21 Cip1表達，并促進HCE細胞增殖能力的恢復。
　　綜上所述，本文以我們自建的非轉染HCE細胞系為體外研究模型，揭示了接觸抑制、TGF-β2和氧化損傷調(diào)控HCE增殖的分子機理，建立了通過安全解除接觸抑制、阻斷TGF-β2的信號傳導和保護氧化損傷使HCE細胞恢復增殖能力的方法。本研究證明非轉染HCE細胞能夠作為有效的體外研究模型被應用于HCE細胞增殖及氧化損傷的研究，本文的研究結果對于刺激體內(nèi)HCE細胞增殖能力恢復，維