腦動靜脈畸形內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型的建立.pdf

1、目的：腦動靜脈畸形（cerebral arteriovenous malformations, cAVM）是常見的顱內(nèi)血管性病變，是由動脈、靜脈及動脈化的靜脈組成的畸形的血管團。在胚胎早期，原始的動脈及靜脈是直接溝通的，以后由于局部毛細血管發(fā)育異常，動脈及靜脈仍然以直接溝通的形式遺留下來。臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的腦出血,其致殘率、致死率極高。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)， cAVM的病理性改變與供血動脈壓力、畸形團、引流靜脈、血流速度和盜血現(xiàn)象相

2、關(guān)。其畸形血管團暴露在異常的高血流和剪切力下，會激活平滑肌細胞和大腦內(nèi)皮細胞的分子通路，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞增殖和血管重構(gòu)。動物模型顯示，畸形血管團的病理改變包括：血管壁不同程度的增厚、彈力層的斷裂，內(nèi)皮細胞層的增厚，內(nèi)皮細胞間粘附連接的缺失，內(nèi)皮細胞連續(xù)不完整和絲狀偽足的缺乏。血管內(nèi)皮細胞作為 cAVM形成機制的首要參與者，在 cAVM的形成過程中起著至關(guān)重要的作用。找到高效、簡便的血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)的方法，建立血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

3、模型，是研究cAVM的形成機制的基礎(chǔ)。
　　方法：選取經(jīng)核磁共振（The Magnetic Resonance Imaging， MRI）、血管造影（Digital Subtraction angiography， DSA）及手術(shù)病理切片明確診斷腦動靜脈畸形的患者10例，癲癇患者顳淺靜脈3例。以上標(biāo)本均來自于北京天壇醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的患者。上述標(biāo)本首先采用組織免疫熒光進行von Willebrand Factor(vWF) and

4、a-smooth muscle action(a-SMA)抗體染色。剩余標(biāo)本通過膠原酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)。經(jīng)流式細胞術(shù)對原代培養(yǎng)的細胞進行分選，篩選出Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，(PECAM-1/CD31)及CD144雙陽性細胞繼續(xù)培養(yǎng)。
　　分選后細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)，再經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定內(nèi)皮細胞純度。將分選后的內(nèi)皮細胞經(jīng)細胞免疫熒光對CD31、CD

5、144、vWF及α-SMA染色。測定內(nèi)皮細胞對Acetylated Low Density Lipoprotein labeled with1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate(Dil-AcLDL)的吞噬能力，進一步證實經(jīng)該實驗方法原代培養(yǎng)的細胞為內(nèi)皮細胞。
　　通過內(nèi)皮細胞遷移、侵襲及成管實驗，對培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的功能進行評估。比較動靜脈畸

6、形患者內(nèi)皮細胞血管生成能力與正常內(nèi)皮之間的差異。
　　結(jié)果：
　　1.一般資料
　　本實驗共統(tǒng)計分析了cAVM患者10名，其中男性7例，女性3例。以腦出血為首發(fā)癥狀者7例，合并癲癇病史者有2例。10位患者顱內(nèi)動靜脈畸形病灶體積大小介于40~70mm之間。每位患者均采用手術(shù)治療，手術(shù)室取材后，進行血管細胞原代培養(yǎng)，通過上述培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，該實驗的成功例數(shù)為7例。腦動靜脈畸形從MRI及DSA影像學(xué)可見動靜脈畸形血管團顯影

7、。
　　2.測定組織的vWF及α-SMA表達。
　　對superficial temporal vein（STV）及cAVM組織行免疫熒光學(xué)檢測vWF及α-SMA的表達水平，結(jié)果所示，在STV及cAVM組可以看出，各組取材均有vWF及α-SMA的表達。vWF定位于內(nèi)皮細胞，而α-SMA定位于血管平滑肌細胞。
　　3.原代細胞培養(yǎng)的分選。
　　通過流式細胞分析儀對原代培養(yǎng)的細胞進行分選，獲取 CD31及CD144雙

8、陽性細胞繼續(xù)培養(yǎng)。
　　4.分選后細胞的形態(tài)學(xué)觀察及流式細胞分析。
　　分選后細胞倒置顯微鏡下可見，STV及 cAVM組細胞為扁圓形或橢圓形，呈鋪路石樣排列。其中可見cAVM組細胞密度較STV組降低，呈抑制性生長。流式細胞分析結(jié)果可看出，該實驗方法得到內(nèi)皮細胞純度較高，其中cAVM組細胞CD31及CD144雙陽性比例為90.60％，STV組CD31及CD144雙陽性細胞比例為98.4%。
　　5.分選后細胞CD31、C

9、D144、vWF、α-SMA的表達。
　　通過細胞免疫熒光檢測STV組及cAVM組細胞CD31、CD144、vWF及α-SMA的表達。從免疫熒光結(jié)果可以看出，各組原代培養(yǎng)的細胞均有CD31、CD144及vWF的表達，證實內(nèi)皮細胞的純度。
　　6.分選后細胞Dil-AcLDL吞噬實驗。
　　從結(jié)果可以看出，STV組及 cAVM組分選后培養(yǎng)細胞均有攝取脂質(zhì)的能力，進一步證實該實驗中原代培養(yǎng)細胞為內(nèi)皮細胞。
　　7.內(nèi)

10、皮細胞的體外成管實驗
　　將cAVM和STV組內(nèi)皮細胞行體外成管實驗。結(jié)果顯示：cAVM組成管長度明顯低于 STV對照組， cAVM組原代培養(yǎng)細胞成管長度為12.58±0.30 mm/mm2， STV組原代培養(yǎng)細胞成管長度為22.42±0.86 mm/mm2(P<0.05, n=3)。
　　8.內(nèi)皮細胞體外遷移力和侵襲力差異表現(xiàn)
　　內(nèi)皮細胞遷移和侵襲實驗中，cAVM內(nèi)皮細胞遷移穿膜細胞數(shù)和侵襲穿膜細胞數(shù)均明顯減少，與

11、STV對照組比較，有顯著的差異(P<0.05)。其中 cAVM內(nèi)皮細胞遷移個數(shù)為596.50±29.07，STV內(nèi)皮細胞遷移個數(shù)為28.42±8.56。而在細胞侵襲實驗中，可以得出cAVM內(nèi)皮細胞侵襲細胞計數(shù)為375.56±24.49，STV內(nèi)皮細胞侵襲個數(shù)為31.50±3.76。說明cAVM組的內(nèi)皮細胞遷移和侵襲能力均較正常對照組明顯下降。
　　結(jié)論：通過膠原酶消化法及流式細胞學(xué)分選行原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)是獲取 cAVM內(nèi)皮細胞的有