腦動(dòng)靜脈畸形內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立.pdf

1、目的：腦動(dòng)靜脈畸形（cerebral arteriovenous malformations, cAVM）是常見的顱內(nèi)血管性病變，是由動(dòng)脈、靜脈及動(dòng)脈化的靜脈組成的畸形的血管團(tuán)。在胚胎早期，原始的動(dòng)脈及靜脈是直接溝通的，以后由于局部毛細(xì)血管發(fā)育異常，動(dòng)脈及靜脈仍然以直接溝通的形式遺留下來。臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的腦出血,其致殘率、致死率極高。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)， cAVM的病理性改變與供血?jiǎng)用}壓力、畸形團(tuán)、引流靜脈、血流速度和盜血現(xiàn)象相

2、關(guān)。其畸形血管團(tuán)暴露在異常的高血流和剪切力下，會(huì)激活平滑肌細(xì)胞和大腦內(nèi)皮細(xì)胞的分子通路，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)。動(dòng)物模型顯示，畸形血管團(tuán)的病理改變包括：血管壁不同程度的增厚、彈力層的斷裂，內(nèi)皮細(xì)胞層的增厚，內(nèi)皮細(xì)胞間粘附連接的缺失，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)不完整和絲狀偽足的缺乏。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為 cAVM形成機(jī)制的首要參與者，在 cAVM的形成過程中起著至關(guān)重要的作用。找到高效、簡(jiǎn)便的血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，建立血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

3、模型，是研究cAVM的形成機(jī)制的基礎(chǔ)。
　　方法：選取經(jīng)核磁共振（The Magnetic Resonance Imaging， MRI）、血管造影（Digital Subtraction angiography， DSA）及手術(shù)病理切片明確診斷腦動(dòng)靜脈畸形的患者10例，癲癇患者顳淺靜脈3例。以上標(biāo)本均來自于北京天壇醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的患者。上述標(biāo)本首先采用組織免疫熒光進(jìn)行von Willebrand Factor(vWF) and

4、a-smooth muscle action(a-SMA)抗體染色。剩余標(biāo)本通過膠原酶消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)原代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分選，篩選出Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，(PECAM-1/CD31)及CD144雙陽(yáng)性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。
　　分選后細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，再經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞純度。將分選后的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒光對(duì)CD31、CD

5、144、vWF及α-SMA染色。測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)Acetylated Low Density Lipoprotein labeled with1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate(Dil-AcLDL)的吞噬能力，進(jìn)一步證實(shí)經(jīng)該實(shí)驗(yàn)方法原代培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。
　　通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲及成管實(shí)驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的功能進(jìn)行評(píng)估。比較動(dòng)靜脈畸

6、形患者內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力與正常內(nèi)皮之間的差異。
　　結(jié)果：
　　1.一般資料
　　本實(shí)驗(yàn)共統(tǒng)計(jì)分析了cAVM患者10名，其中男性7例，女性3例。以腦出血為首發(fā)癥狀者7例，合并癲癇病史者有2例。10位患者顱內(nèi)動(dòng)靜脈畸形病灶體積大小介于40~70mm之間。每位患者均采用手術(shù)治療，手術(shù)室取材后，進(jìn)行血管細(xì)胞原代培養(yǎng)，通過上述培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，該實(shí)驗(yàn)的成功例數(shù)為7例。腦動(dòng)靜脈畸形從MRI及DSA影像學(xué)可見動(dòng)靜脈畸形血管團(tuán)顯影

7、。
　　2.測(cè)定組織的vWF及α-SMA表達(dá)。
　　對(duì)superficial temporal vein（STV）及cAVM組織行免疫熒光學(xué)檢測(cè)vWF及α-SMA的表達(dá)水平，結(jié)果所示，在STV及cAVM組可以看出，各組取材均有vWF及α-SMA的表達(dá)。vWF定位于內(nèi)皮細(xì)胞，而α-SMA定位于血管平滑肌細(xì)胞。
　　3.原代細(xì)胞培養(yǎng)的分選。
　　通過流式細(xì)胞分析儀對(duì)原代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分選，獲取 CD31及CD144雙

8、陽(yáng)性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。
　　4.分選后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞分析。
　　分選后細(xì)胞倒置顯微鏡下可見，STV及 cAVM組細(xì)胞為扁圓形或橢圓形，呈鋪路石樣排列。其中可見cAVM組細(xì)胞密度較STV組降低，呈抑制性生長(zhǎng)。流式細(xì)胞分析結(jié)果可看出，該實(shí)驗(yàn)方法得到內(nèi)皮細(xì)胞純度較高，其中cAVM組細(xì)胞CD31及CD144雙陽(yáng)性比例為90.60％，STV組CD31及CD144雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為98.4%。
　　5.分選后細(xì)胞CD31、C

9、D144、vWF、α-SMA的表達(dá)。
　　通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)STV組及cAVM組細(xì)胞CD31、CD144、vWF及α-SMA的表達(dá)。從免疫熒光結(jié)果可以看出，各組原代培養(yǎng)的細(xì)胞均有CD31、CD144及vWF的表達(dá)，證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的純度。
　　6.分選后細(xì)胞Dil-AcLDL吞噬實(shí)驗(yàn)。
　　從結(jié)果可以看出，STV組及 cAVM組分選后培養(yǎng)細(xì)胞均有攝取脂質(zhì)的能力，進(jìn)一步證實(shí)該實(shí)驗(yàn)中原代培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。
　　7.內(nèi)

10、皮細(xì)胞的體外成管實(shí)驗(yàn)
　　將cAVM和STV組內(nèi)皮細(xì)胞行體外成管實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：cAVM組成管長(zhǎng)度明顯低于 STV對(duì)照組， cAVM組原代培養(yǎng)細(xì)胞成管長(zhǎng)度為12.58±0.30 mm/mm2， STV組原代培養(yǎng)細(xì)胞成管長(zhǎng)度為22.42±0.86 mm/mm2(P<0.05, n=3)。
　　8.內(nèi)皮細(xì)胞體外遷移力和侵襲力差異表現(xiàn)
　　內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，cAVM內(nèi)皮細(xì)胞遷移穿膜細(xì)胞數(shù)和侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少，與

11、STV對(duì)照組比較，有顯著的差異(P<0.05)。其中 cAVM內(nèi)皮細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)為596.50±29.07，STV內(nèi)皮細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)為28.42±8.56。而在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，可以得出cAVM內(nèi)皮細(xì)胞侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)為375.56±24.49，STV內(nèi)皮細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)為31.50±3.76。說明cAVM組的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲能力均較正常對(duì)照組明顯下降。
　　結(jié)論：通過膠原酶消化法及流式細(xì)胞學(xué)分選行原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)是獲取 cAVM內(nèi)皮細(xì)胞的有