戒煙對長期吸煙誘發(fā)肺氣腫模型氣道炎癥轉(zhuǎn)歸的影響及機制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病，預(yù)計到2020年，COPD將成為全球主要死因的第3位[1]。吸煙被證實是COPD最危險的致病因素，所有吸煙者的肺部均發(fā)生炎癥反應(yīng)，但是吸煙COPD者肺部炎癥反應(yīng)增強并且持續(xù)發(fā)展最終導(dǎo)致持續(xù)性氣流受限[2-3]，戒煙是目前可以預(yù)防和延緩肺功能下降的最有效治療手段，但是COPD患者戒煙后氣道炎癥反應(yīng)長時間持續(xù)[4]。<

2、br>　　COPD肺部過度放大并且持續(xù)進展的炎癥反應(yīng)的特點，提示炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機制異常，研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的小氣道壁周圍和肺間質(zhì)內(nèi)天然免疫細胞（巨噬細胞、中性粒細胞等）和獲得性免疫細胞的浸潤明顯增加[5-7]，并且隨著COPD病情的進展，伴隨淋巴濾泡形成的氣道數(shù)明顯增加[8-10]，提示特異性抗原誘導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答參與了COPD病程的進展，COPD可能是一種自身免疫性疾病;而自身免疫性肺氣腫動物模型的建立[11]，說明該疾病的的發(fā)生過

3、程包括天然和獲得性免疫應(yīng)答成分，香煙煙霧損傷上皮細胞和細胞外基質(zhì)，被天然免疫細胞識別，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，進一步激活中性粒細胞和肺泡巨噬細胞，分別產(chǎn)生彈性蛋白酶(NE)和基質(zhì)金屬蛋白酶-12(MMP-12)[12]，降解彈性蛋白;經(jīng)過特異性細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞）呈遞抗原誘導(dǎo)獲得性免疫細胞（T、B淋巴細胞）活化增殖并趨化到病變組織部位產(chǎn)生免疫效應(yīng);有學(xué)者認為COPD是從非特異炎癥過程向獲得性免疫過程發(fā)展，而這種異常的獲得性免疫主要是

4、由于免疫細胞的選擇、調(diào)節(jié)異常，或者是產(chǎn)生了新的抗原[13]。那么，戒煙后肺內(nèi)免疫細胞的選擇和募集，以及參與免疫調(diào)節(jié)的炎性介質(zhì)會如何變化，對探討戒煙后持續(xù)氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生機制有重大意義。
　　肺泡巨噬細胞在天然和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，并且具有顯著的異質(zhì)性和多種生物學(xué)功能，包括噬菌、殺菌、促炎或抗炎作用等。另外，還可通過分泌細胞因子、共刺激分子和抗原提呈等途徑發(fā)揮特異性和非特異性免疫調(diào)節(jié)功能[17-19]。近年不同的巨噬細胞

5、亞型已被證實，前炎性或者是經(jīng)典激活巨噬細胞(M1)，可在輔助性T細胞1型(Th1)分泌細胞因子（γ-干擾素和腫瘤壞死因子）環(huán)境中被細菌脂多糖(LPS)及炎性物質(zhì)和/或微生物激活。通過分泌NO和促炎性細胞因子、腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素-1（IL-1）和IL-6等，表現(xiàn)出前炎性和細胞毒活性，可以清除細胞內(nèi)病原體，同時還可以分泌IL-12促進Th1細胞的分化[17,19]。與之相反，抗炎性或者是替代激活巨噬細胞(M2)在Th2型細胞

6、因子（IL-4和IL-13）的環(huán)境中發(fā)育，通過IL-10和TGF-β發(fā)揮特殊的免疫調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)為選擇性免疫抑制和抑制淋巴細胞增殖，在炎癥慢性期及慢性疾病的損傷組織重塑修復(fù)中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[14-1620]。M2型巨噬細胞表達豐富的甘露糖受體，另外，還可以特異地表達抗炎IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)，IL-1誘導(dǎo)受體(IL-1 decoy receptor)、替代巨噬細胞激活相關(guān)CC趨化因子1(AMAC-1)等。近年來，人們發(fā)

7、現(xiàn)FIZZ1、YM1和精氨酸酶Ⅰ基因[21,22]（在替代激活巨噬細胞發(fā)揮功能時特異表達的基因）是M2型巨噬細胞存在的主要分子標(biāo)志[14,23-24]。
　　我們推測，吸煙在敏感人群中可能通過誘導(dǎo)細胞因子分泌，抑制M2型巨噬細胞的活化，從而促進氣道炎癥進展和COPD的形成，而戒煙后隨著肺內(nèi)微環(huán)境細胞因子成分的改變，巨噬細胞的表型、功能可能也會發(fā)生轉(zhuǎn)變;但是在吸煙不同階段戒煙后炎性-抗炎性的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)歸，巨噬細胞分化的方向尚需深入

8、研究;鑒于COPD戒煙前后氣道黏膜炎癥反應(yīng)無明顯改善，我們預(yù)計戒煙可能也不能改善M2抑制現(xiàn)象;也就是說在敏感人群中，吸煙是通過免疫調(diào)節(jié)異常促進了持續(xù)的炎癥反應(yīng)，并且和戒煙后持續(xù)存在的氣道炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。C57BL/6J小鼠對煙熏普遍敏感，國際通用煙熏24周建立肺氣腫動物模型25-26]，本研究采用煙熏4周和24周后戒煙建立吸煙早期和肺氣腫戒煙小鼠動物模型，所有小鼠均在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，避免呼吸道感染，觀察吸煙誘導(dǎo)氣道炎癥和煙熏肺氣腫

9、戒煙后小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化;以支氣管肺泡灌洗液((bronchoalveolar lavagefluid，BALF)中炎癥細胞的浸潤和炎性-抗炎性細胞因子的表達來評價炎癥反應(yīng)的強度;分離純化小鼠原代肺泡巨噬細胞，觀察M2型巨噬細胞代表性基因FIZZ1和精氨酸酶Ⅰ的表達變化;比較兩者之間的區(qū)別;探討免疫調(diào)節(jié)機制在吸煙誘導(dǎo)的進行性發(fā)展的氣道炎癥反應(yīng)中的作用，為COPD戒煙后持續(xù)炎癥反應(yīng)的發(fā)生提供理論依據(jù)。
　　實驗方法:
　

10、　1、實驗動物熏煙
　　從中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗室購入雌性C57BL/6J小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實驗。小鼠隨機分為熏煙A組、B組和正常對照C組和D組，A組和B組分別用自制熏箱煙霧暴露4周和24周（每次煙霧暴露去過濾嘴香煙10支，每天兩次，每次1小時余，每周5天），實驗用煙為市售紅金龍牌香煙（武漢卷煙廠生產(chǎn)，焦油含量15mg/支，煙氣煙堿量1.1mg/支），正常對照組是僅將動物置入干凈的熏箱于同樣長時間，但不熏煙（C組

11、4周，D組24周）。達累計熏煙時間后停止熏煙，A組在戒煙后7天和4周取材，B組在戒煙后3、5、7、10天和3、5、8周取材。
　　2、實驗動物的病理檢測
　　小鼠左肺以25cmH20壓力灌注10％中性福爾馬林緩沖液行氣管內(nèi)固定，再在10％中性福爾馬林緩沖液內(nèi)固定24-48小時，沿矢狀面將其切割成2mm大小的組織塊，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm的切片，HE染色，根據(jù)Cosio[27]等設(shè)計的小氣道病變評估方法和標(biāo)準(zhǔn)，選取直徑在70

12、0-1200μm（管徑最短徑/最長徑≥0.7）的膜性細支氣管，由不知分組資料的兩位病理科醫(yī)生進行盲法閱片。參照Kawakami和Thurlbeck[28]方法，以平均線性截距(Lm)測量肺實質(zhì)空氣腔大小，確定肺氣腫的形成。
　　3、采集肺泡灌洗液
　　小鼠深度麻醉，經(jīng)BD靜脈留置針氣管插管并固定，用無菌生理鹽水灌洗小鼠肺部，收集灌洗液后離心取上清液，-80℃的深度冰箱中保存，用于檢測BALF中細胞因子的蛋白表達水平。

13、　　4、肺泡灌洗液中的細胞計數(shù)
　　將支氣管肺泡灌洗液離心后得到的沉淀溶于生理鹽水中，制成細胞懸液，顯微鏡下應(yīng)用血細胞計數(shù)器直接計數(shù)總細胞數(shù)。取部分細胞懸液涂片，瑞氏染色，顯微鏡下分數(shù)中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞，計算三種炎細胞的百分比。
　　5、支氣管肺泡灌洗液中的炎性-抗炎性細胞因子的檢測
　　應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測BALF中炎性-抗炎性細胞因子的蛋白表達。包括:IL-1β、IL-12、IL-4、TGF-β、和IL

14、-10。
　　6、原代肺泡巨噬細胞的分離純化
　　小鼠麻醉，75％酒精消毒，固定于操作臺，分離氣管，BD留置針行氣管插管并固定，抽取37℃含1％胎牛血清(FCS)的PBS1ml，緩慢推入氣管，輕揉肺部，停留1 min后再回抽，以上操作重復(fù)10次，回收的支氣管肺泡灌洗液移至超凈臺，注入帶塞的離心管內(nèi)，用200目的無菌濾網(wǎng)過濾，離心，沉淀的細胞團用RPMI1640培養(yǎng)液重懸洗滌細胞兩次，離心，棄上清，再用含有10％FBS的RPM

15、I1640培養(yǎng)液懸浮細胞，制成單細胞懸液，加至35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，充分混勻后在37℃、5％C02、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，使巨噬細胞貼壁，PBS反復(fù)沖洗，除去未貼壁細胞，得到純化的肺泡巨噬細胞(AM)。
　　7、原代巨噬細胞的鑒定:特異性表型MAC-3表達的免疫組織化學(xué)鑒定
　　向培養(yǎng)瓶中加入EDTA-2Na，以使貼壁細胞脫落，離心，RPMI1640洗滌，重懸，將純化的AM粘附生長于蓋玻片上，4％多聚甲醛溶液固定，0

16、.1 M PBS洗滌，3％H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，0.1 M PBS洗滌，正常兔血清封閉，滴加一抗（大鼠抗小鼠MAC-3單抗），4℃過夜，0.1 M PBS洗滌，滴加二抗(兔抗大鼠IgG)，37℃15min，DAB溶液顯色，自來水終止，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡觀察拍照。
　　8、M2型肺泡巨噬細胞代表性基因FIZZ1和精氨酸酶Ⅰ mRNA表達水平的檢測
　　按照Trizol試劑說明書，提取純化AM的總RNA;

17、按照SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit說明書合成cDNA第一鏈。南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計和合成FIZZ1、精氨酸酶Ⅰ（ArgⅠ）及內(nèi)參GAPDH的特異性引物。應(yīng)用SYBR GreenMaster mix擴增cDNA，通過ABI7500 thermocycler分析。
　　9、統(tǒng)計學(xué)分析
　　本研究應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，統(tǒng)計結(jié)果表述為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析比較不同組的實驗數(shù)據(jù)

18、;當(dāng)組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時，采用LSD法進行組間比較， P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果:
　　1、小鼠肺組織氣道病變在煙熏不同階段戒煙后的轉(zhuǎn)歸和區(qū)別
　　(1)煙熏4周誘導(dǎo)肺組織氣道炎癥病變在戒煙后一周已經(jīng)明顯改善，4周時基本恢復(fù)到健康對照水平。
　　(2)煙熏24周小鼠的肺組織氣道炎癥病變比4周小鼠顯著加重，肺泡隔斷裂、肺泡腔擴大、平均線性截距顯著增加，形成肺氣腫;戒煙后直至8周，氣道、血管周圍和

19、肺間質(zhì)內(nèi)的炎性細胞浸潤仍較健康對照組顯著。
　　2、小鼠在熏煙不同階段戒煙后支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞分布的轉(zhuǎn)歸和區(qū)別
　　(1)煙熏4周小鼠BALF中細胞總數(shù)較正常對照小鼠明顯增加，中性粒細胞(N)百分比顯著增高，肺泡巨噬細胞(AM)百分比下降而淋巴細胞(L)百分比無顯著差異。
　　(2)早期戒煙鼠N百分比在戒煙7天時明顯下降，恢復(fù)到正?；€水平，而AM百分比反而增加，7天和4周沒有顯著差異，L百分比戒煙前后無顯著區(qū)

20、別。
　　(3)肺氣腫小鼠BALF中細胞總數(shù)較正常對照小鼠和煙熏4周小鼠均明顯增加，和煙熏4周小鼠相同，N百分比和L百分比顯著增加，AM百分比下降。
　　(4)肺氣腫小鼠BALF中細胞總數(shù)戒煙后8周仍不能恢復(fù)正常，并且AM百分比和L百分比直到戒煙仍和正常對照小鼠有顯著差異，而N百分比在戒煙3周時恢復(fù)到正常水平。
　　3、炎性-抗炎性細胞因子在熏煙不同階段戒煙后的轉(zhuǎn)歸和區(qū)別
　　(1)與正常對照組相比，煙熏4周小鼠

21、肺組織勻漿中IL-1β、IL-4和TGF-β顯著增加;IL-10也增高，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.078); IL-12無顯著區(qū)別。
　　(2)煙熏4周小鼠戒煙后7天增高的IL-1β和TGF-β比戒煙前顯著下降，恢復(fù)到正常水平，而IL-4戒煙后無明顯下降，4周時仍顯著高于正常對照組;IL-10和IL-12戒煙前后沒有顯著改變。
　　(3)與正常對照組相比，煙熏24周小鼠BALF中IL-1β和IL-12顯著高于正常對照小鼠，I

22、L-10和TGF-β顯著下降，IL-4無明顯區(qū)別。
　　(4)煙熏24周小鼠IL-1β和IL-12均在戒煙3天時下降至正常水平，雖然IL-12有一過性再次增高，但不能持續(xù)，隨戒煙時間延長仍能恢復(fù)，IL-1β在戒煙5和8周時甚至低于正常水平;相反，下降的IL-10和TGF-β戒煙后8周仍不能恢復(fù);IL-4戒煙前后無差異。
　　4、M2型巨噬細胞在煙熏肺氣腫小鼠戒煙后的轉(zhuǎn)歸
　　長期熏煙抑制M2型巨噬細胞的活化，肺氣腫小鼠

23、戒煙后3天有一過性的M2型巨噬細胞分化增多，恢復(fù)到健康水平;但是不能持續(xù)，戒煙后5天再次明顯下降，并且一直到戒煙后8周仍不能恢復(fù)。
　　結(jié)論:
　　1、吸煙誘導(dǎo)的氣道病變和炎癥反應(yīng)在早期戒煙時可逆。
　　2、吸煙誘導(dǎo)肺氣腫后再戒煙，氣道-肺病理損傷無明顯改善，早戒煙機體獲益更大。
　　3、戒煙可以明顯改善肺氣腫BALF中的炎細胞浸潤，但是異常的肺泡巨噬細胞和淋巴細胞比例戒煙后持續(xù)存在。
　　4、戒煙對肺氣腫