牙周炎相關(guān)表觀遺傳學酶的篩選及分析.pdf

1、健康的牙周組織是正常牙齒發(fā)揮功能的保障，而牙周炎的發(fā)生往往導致牙周組織的漸進性破壞，如未得到及時治療，最終造成牙齒松動脫落，現(xiàn)已成為我國成年人牙齒缺失的首要原因。不僅如此，已有研究證實牙周炎與全身多系統(tǒng)的發(fā)病率具有相關(guān)性如心腦血管疾病、低體重早產(chǎn)兒、糖尿病等。因此牙周炎的防治逐漸成為人們關(guān)注的話題。眾所周知，牙周炎是一種以菌斑為始動因素的多因素疾病，目前臨床上治療牙周炎的方法主要以控制菌斑為主，主要包括潔治術(shù)、刮治術(shù)、翻瓣術(shù)等，能夠有效

2、延緩/控制牙周炎的發(fā)生，但臨床上有時會發(fā)現(xiàn)這樣的現(xiàn)象：口腔衛(wèi)生較差的患者，其牙周炎的病變程度較輕，而口腔衛(wèi)生較好的患者可能伴有嚴重的牙周病損。同樣臨床表征的患者采用同種治療方法后，患者的疾病預后也不盡相同。為了解釋這些現(xiàn)象，有研究發(fā)現(xiàn)飲食、吸煙、口腔環(huán)境、細菌等因素可以通過影響宿主參與炎癥反應(yīng)的基因，從而影響口腔健康。而近年來發(fā)現(xiàn)這些因素皆與表觀遺傳具有相關(guān)性。
　　表觀遺傳是與遺傳相對提出的，是指DNA序列不發(fā)生變化，而基因表達

3、發(fā)生了可遺傳性變化，此種變化是細胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)的改變，且在發(fā)育和細胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾及染色體重塑等多種形式，其中DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳的兩種主要方式。表觀遺傳修飾滲透了人類健康與疾病的全部領(lǐng)域。表觀遺傳修飾，在功能上，是基因組適應(yīng)環(huán)境變化的一種有效手段；在機制上，是通過各種不影響DNA序列的方法對基因表達進行調(diào)控；由于生物總是要對環(huán)境的各種變化進行適應(yīng)，而同

4、時要竭力維持遺傳序列的穩(wěn)定性，這就使得表觀遺傳修飾幾乎每時每刻都在發(fā)生著變化，表觀遺傳的發(fā)生主要由表觀遺傳學酶來調(diào)控?，F(xiàn)有研究表明，表觀遺傳與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性變及類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。那么，在牙周炎的發(fā)生過程中表觀遺傳是否參與其中，有哪些表觀遺傳學酶發(fā)生了變化，哪些表觀遺傳學酶可能為關(guān)鍵酶，這些酶又是如何影響細胞的生物學性能從而影響牙周健康的，有待進一步的探索，這對于牙周病的診治和識別患者的患病風險具有潛在

5、意義。
　　目的:
　　通過分離培養(yǎng)同一患者來源的炎癥牙周膜干細胞（inflamed periodontal ligament stem cells，i-PDLSCs）和正常牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）,以PDLSCs為對照，篩選i-PDLSCs中變化明顯的表觀遺傳學酶，并驗證目標酶對牙周膜干細胞增殖能力的影響，為表觀遺傳與牙周炎的相關(guān)性提供理論依據(jù)。
　

6、　方法:
　　1.炎性牙周膜干細胞（i-PDLSCs）和正常牙周膜干細胞（PDLSCs）的分離、純化培養(yǎng)和鑒定
　　我們選取同一患者因牙周炎而拔除的無功能牙和因阻生而拔除的新鮮健康第三磨牙，采用酶消化與組織塊聯(lián)合法分別分離培養(yǎng)原代正常和炎癥牙周膜細胞；采用有限稀釋法純化i-PDLSCs和PDLSCs；使用流式細胞儀對分離純化出的兩種細胞的干細胞相關(guān)表面標記物進行檢測及鑒定；采用MTT及克隆形成方法檢測兩種細胞增殖能力；采用成

7、骨、成脂誘導實驗對兩種細胞的多向分化潛能進行檢測。
　　2.牙周炎相關(guān)表觀遺傳學酶的篩選
　　通過文獻查閱獲得已有相關(guān)報道的表觀遺傳各家族酶共72個（附表1）。通過將同一患者來源的i-PDLSCs和PDLSCs對比，篩選牙周炎過程中變化明顯的表觀遺傳學酶，首先分別收集兩種細胞，提取兩種細胞總RNA，通過實時定量PCR進行篩選，以PDLSCs為對照組，確定i-PDLSCs中變化較為明顯的表觀遺傳學酶。為進一步驗證所篩選的結(jié)果，

8、利用TNF-α對PDLSCs進行炎性刺激以模擬炎性環(huán)境，收集正常組與炎性誘導組細胞，提取總RNA后通過RT-PCR篩選兩組中變化較為明顯的表觀遺傳學酶。根據(jù)體內(nèi)炎性環(huán)境直接來源的i-PDLSCs及體外炎性刺激來源的i-PDLSCs所篩選的兩組結(jié)果，確定牙周炎相關(guān)表觀遺傳學酶。
　　3. KAT2A對牙周膜干細胞增殖能力的影響
　　根據(jù)實驗二的篩選結(jié)果及相關(guān)文獻報道，我們選定KAT2A為本實驗的目標表觀遺傳學酶，并對其進行功能

9、驗證。為探尋表觀遺傳學酶對牙周膜干細胞的影響，我們首先通過蛋白免疫印跡法（WB）驗證所篩選出的目標酶 KAT2A在i-PDLSCs和PDLSCs中的表達情況；然后利用KAT2A si-RNA對PDLSCs進行目標酶表達沉默，通過RT-PCR及 WB進行沉默效能檢測；成功沉默后，對沉默前后兩組細胞的增殖能力采用MTT法、克隆形成、流式細胞儀檢測細胞周期法以及RT-PCR檢測細胞周期相關(guān)基因CCD1、CCE1及E2F1的表達情況進行檢測。<

10、br>　　4.統(tǒng)計學分析
　　所有數(shù)據(jù)使分別用SPSS19.0和GraphPad Prism5進行統(tǒng)計和作圖分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差（X±SD）形式表示，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.本實驗共取材12例，其中i-PDLSCs培養(yǎng)成功8例，PDLSCs培養(yǎng)成功10例，共同培養(yǎng)成功7例。3-7d顯微鏡下可以觀察到貼壁細胞，細胞形態(tài)呈梭形，集落樣生長。有限稀釋法挑選單細胞克隆

11、，擴大培養(yǎng)后獲得兩種高純度干細胞。流式細胞檢測結(jié)果顯示兩種細胞均陽性表達CD146、CD105，陰性表達造血干細胞標記CD45和內(nèi)皮干細胞表面標記 CD31。MTT檢測發(fā)現(xiàn)兩種細胞均具有較強的增殖能力，但i-PDLSCs的增殖能力明顯。茜素紅染色后兩種細胞均可以觀察到礦化結(jié)節(jié)，油紅O染色后鏡下均可以觀察到脂滴。證明我們所分離、純化培養(yǎng)的兩種細胞為高純度的人牙周膜干細胞。
　　2.分別提取同一患者來源i-PDLSCs和PDLSCs兩

12、種細胞總RNA，通過RT-PCR觀察兩種細胞中表觀遺傳學酶表達情況，結(jié)果顯示表觀遺傳學酶在i-PDLSCs和PDLSCs兩組中表達并不一致，這與我們預期的情況是相符的。根據(jù)原始篩選結(jié)果中組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶家族的變化情況以及以往研究，我們確定組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶為重點篩查家族。RT-PCR篩查結(jié)果顯示多數(shù)組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶在i-PDLSCs組中表達較PDLSCs低。分析總結(jié)各組樣本RT-PCR篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)：多數(shù)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（KAT2A

13、、ELP3、HAT1、KAT6A和KAT6B）在i-PDLSCs組中表達較PDLSCs組低，少數(shù)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（NCOA3和GTF3C4）在i-PDLSCs中表達較PDLSCs組高。
　　進一步利用TNF-α炎性因子體外模擬炎性環(huán)境對PDLSCs進行炎性刺激，收集正常組與炎性刺激組細胞，提取總RNA，通過RT-PCR篩選兩組中變化較為明顯的表觀遺傳學酶。篩選結(jié)果與上述結(jié)果基本一致，即多數(shù)組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶在炎性環(huán)境下表達呈下降

14、趨勢。分析總結(jié)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，KAT2A、KAT6A和KAT6B的表達在炎癥組及炎性刺激組中表達降低。
　　3.根據(jù)實驗二的篩選結(jié)果及相關(guān)文獻報道，我們選定 KAT2A為本實驗的目標表觀遺傳學酶，并對其功能進行驗證。使用 si-RNA沉默 PDLSCs中 KAT2A的表達，RT-PCR及WB檢測顯示，沉默效率達到50％，說明我們在PDLSCs中成功沉默了KAT2A。KAT2A沉默后，其克隆集落形成能力、增殖能力均較沉默

15、前明顯下降（P<0.05）。流式細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，沉默 KAT2A后，S期細胞明顯下降，多數(shù)阻滯于G1期。另外，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，，KAT2A沉默后細胞周期素CCD1、CCE1及E2F1表達量較沉默前也均有所降低。
　　結(jié)論:
　　1.正常來源與炎性來源牙周膜干細胞均可成功分離，純化培養(yǎng)后，經(jīng)流式檢測、MTT檢測、克隆形成實驗、成脂及成骨誘導分化確定，兩者均符合間充質(zhì)干細胞特性。
　　2.炎性微環(huán)境影響了PDLSC