大鼠口腔黏膜上皮細胞誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向上皮細胞分化的體外研究.pdf

1、各種原因導致陰道缺失的患者需要進行陰道成形術，傳統(tǒng)手術存在著犧牲正常組織、遺留瘢痕、免疫排斥等問題。組織工程技術為陰道重建提供理想的組織襯里，并且重建的陰道有理想的深度和寬度，彌補了傳統(tǒng)手術形成的人工陰道在形態(tài)和功能上的不足。種子細胞是進行組織工程化組織構建的最為關鍵的要素，只有獲得足夠數(shù)量并保持特定生物學活性的種子細胞，才能保證組織構建的成功。目前陰道組織工程的種子細胞大都采用自體組織的同源細胞，但是存在著來源有限、細胞易老化、不能大

2、規(guī)模擴增以及細胞取材對機體造成新的創(chuàng)傷等不足，因此，骨髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)向上皮細胞的誘導分化是其在陰道組織工程中應用的關鍵步驟。本研究嘗試應用大鼠口腔黏膜上皮細胞體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向上皮細胞誘導分化，為BMSCs作為種子細胞應用于陰道組織工程奠定基礎。
　　 第一部分，原代培養(yǎng)大鼠口腔黏膜上皮細胞的研究
　　 目的:探討大鼠口腔黏膜上皮細胞體外

3、培養(yǎng)方法，以應用于誘導BMSCs向上皮細胞分化的研究。
　　 方法:取大鼠口腔黏膜組織，分別用PBS配制的0.6U/ml的DispaseⅡ和D-KSFM配制的0.6U/ml的DispaseⅡ，D-KSFM配制的0.6U/ml的DispaseⅡ和D-KSFM配制的1.2U/ml的DispaseⅡ，記錄每組上皮分離結果的評分及可獲活細胞數(shù)，倒置相差顯微鏡下觀察首次換液時細胞貼壁情況;分別用胰酶消化10min×二次和20min×一次方

4、法，用KBM-GOLD培養(yǎng)基和含6％FBS的KBM-GOLD培養(yǎng)基培養(yǎng)，記錄每組上皮可獲活細胞數(shù)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，掃描電鏡觀察細胞超微結構，免疫組化及免疫熒光鑒定。
　　 結果:PBS配制組與D-KSFM配制組相比，兩者分離結果評分基本一致，無統(tǒng)計學差異(P=1.0＞0.05），可獲活細胞數(shù)小于D-KSFM配制組，兩組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05），首次換液時可見D-KSFM配制組貼壁細胞較多;1.2U/ml組與0.6

5、U/ml組相比，上皮層更易完整分離，分離結果評分及可獲活細胞數(shù)更高，有統(tǒng)計學意義(P=0.025＜0.05;P=0.036＜0.05);胰酶消化10min×二次組可獲活細胞數(shù)高于20min×一次組，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.388)，首次換液時倒置顯微鏡下觀察胰酶多次消化組貼壁細胞更多;大鼠口腔黏膜上皮細胞在KBM-GOLD培養(yǎng)基中48h可見成簇貼壁細胞，3-6天細胞稍增多，7-8天逐漸融合，呈鋪路石樣外觀，在含6％FBS的KBM-GO

6、LD培養(yǎng)基中生長快，4-6天可達約85％融合，但夾有長梭形的成纖維細胞，上皮細胞形態(tài)發(fā)生改變。倒置顯微鏡下見上皮細胞呈不規(guī)則圓形或多邊形，連接成片后似鋪路石狀。掃描電鏡下細胞表面可見微絨毛嵴。廣譜角蛋白AE1/AE3免疫組化染色為陽性，免疫熒光示胞漿紅色。
　　 結論:依次使用D-KSFM配制的1.2U/ml的DispaseⅡ和胰酶消化10min×二次，在KBM-GOLD培養(yǎng)基中可獲得更多的口腔黏膜上皮細胞，并顯示上皮細胞特征。

7、
　　 第二部分，體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向上皮細胞分化的研究
　　 目的:探討大鼠口腔黏膜上皮細胞體外誘導BMSCs向上皮細胞分化的培養(yǎng)方法，為BMSCs作為種子細胞應用于陰道組織工程提供依據(jù)。
　　 方法:取大鼠口腔黏膜組織，用DispaseⅡ和胰酶分步消化，獲取上皮細胞，接種于Transwellinsert小室，取第三代至第五代生長良好BMSCs以3×103/cm2（共培養(yǎng)14天）和5×103/cm2（

8、共培養(yǎng)7天）接種于六孔板，靜置培養(yǎng)貼壁后，與在Transwellinsert小室中培養(yǎng)2天的大鼠口腔上皮細胞共培養(yǎng)，加入含3％FBS的KBM-GOLD培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，共培養(yǎng)14天的transwellinsert小室在第8天時更換一次。每天在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學變化，分別在共培養(yǎng)的第7、14天，通過免疫組織化學和westernblot鑒定上皮細胞特異性標志物廣譜角蛋白的表達。
　　 結果:誘導初期細胞成長條梭型，大小均一，無明

9、顯突起，當共培養(yǎng)第7天時，少量細胞變成圓形或橢圓形，周圍有短的絨毛樣突起，核呈圓形或橢圓形，胞漿豐富，AE1/AE3染色后部分細胞為陽性，胞漿呈棕黃色顆粒;誘導培養(yǎng)14天時，圓形或橢圓形細胞明顯增多，AE1/AE3陽性表達細胞明顯增多，并且細胞排列方式發(fā)生了變化，誘導后的細胞排列不規(guī)則或聚集成團。westernblot結果顯示誘導后的細胞有廣譜角蛋白表達，并且14天時表達水平比7天明顯增加。
　　 結論:體外大鼠口腔上皮細胞與B