臍血間充質(zhì)干細胞體外分化為鼻黏膜纖毛上皮細胞的研究.pdf

1、慢性鼻竇炎(Ⅱ、Ⅲ型)鼻腔鼻竇手術(shù)后常須進行長期的隨訪治療，以防術(shù)腔鼻黏膜瘢痕粘連及炎癥復(fù)發(fā)。嚴重的黏膜病變還可能伴有免疫功能異常，如變應(yīng)性鼻炎、哮喘、囊性纖維化、先天性纖毛不動綜合征等。如何使病變或受損的鼻腔黏膜重新發(fā)揮正常功能是國內(nèi)外鼻科學(xué)者關(guān)注的問題。近來研究表明小鼠胚胎干細胞和成人骨髓間充質(zhì)干細胞可以分化成為纖毛細胞。但前者涉及倫理學(xué)，無法在人體進行研究，后者分化較差。臍帶血含有豐富的造血干細胞/祖細胞(HSCs)和間充質(zhì)干細胞

2、(MSCs)，取材方便，來源廣泛；受到胎盤屏障保護，其成分被病毒、細菌污染概率低；臍帶血免疫系統(tǒng)較為原始，降低了移植后受體的排異反應(yīng)；臍帶血中含有豐富的干細胞，更為原始并具有有更強的分化能力；不涉及社會、法律及倫理方面的爭議；臍帶血不僅可以作為異體基因移植的供體，而且還可以低溫保存數(shù)十年。因此，以臍血間充質(zhì)干細胞作為組織修復(fù)材料具有廣闊的前景。為了探索臍血間充質(zhì)干細胞是否能向鼻黏膜上皮分化，進行了以下研究。 第一部分，體外臍血間

3、充質(zhì)干細胞培養(yǎng)體系的建立。 目的：探討臍血MSCs的分離、培養(yǎng)、純化和擴增的方法及規(guī)律，研究其生物學(xué)特性，進一步探討體外誘導(dǎo)臍血MSCs向纖毛上皮定向分化的可行性和誘導(dǎo)條件，為研究臍血MSCs作為種子細胞來治療鼻科疾病提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 方法：取孕34～40周產(chǎn)婦自然分娩或剖宮產(chǎn)胎兒的臍血20～80mL，分別采用羥乙基淀粉分離法和淋巴細胞分離液法分離單個核細胞。將DMEM/F12+10％胎牛血清加入離心管中，吹打制

4、成單細胞懸液。以適當(dāng)密度接種于胎牛血清(FBS)包被的6孔板中，置于37℃、飽和濕度，體積分數(shù)為5％CO2孵箱中培養(yǎng)。7d首次全量換液，去掉未貼壁的懸浮細胞，以后每5天換液1次。待細胞長到80％匯合時，以1：1的0.25％胰酶/0.02EDTA混合液消化傳代，每日在倒置相差顯微鏡下觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態(tài)特征。流式細胞儀鑒定P3代細胞表面標(biāo)志CD44、CD13、CD45、CD34，并取第3代細胞測定細胞周期。 結(jié)果：采

5、用淋巴細胞分離液和羥乙基淀粉分離法均成功分離出MSCs。原代培養(yǎng)于2-4周時細胞可達80％匯合，此時可以傳代。傳至第3代時細胞形態(tài)較均一，折光性好。經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，P3代臍血間充質(zhì)干細胞穩(wěn)定地高表達CD13、CD44等表面抗原標(biāo)記物，陽性率分別為86.18％、90.30％，弱表達CD34、CD45等造血細胞標(biāo)志，表明MSCs是存在于臍帶血中區(qū)別于造血細胞的一群非定向干/祖細胞，這與骨髓MSCs的表面抗原標(biāo)志相一致。第3代臍血單

6、個核細胞周期分析顯示95.29％的細胞處在G0/G1期。18份臍血，都分離出不同量的單核細胞，只有3份孕34-37周和1份孕38周的的胎兒臍血得到足量可以傳代的梭形細胞，占22％。 結(jié)論：早產(chǎn)胎兒臍血更易得到可以傳代和純化的干細胞，可能與其臍血中間充質(zhì)干細胞量更多有關(guān)。但是足月胎兒臍血也可以獲得一定數(shù)量純化和具有增殖分化能力的干細胞。目前各種優(yōu)化條件還在研究中，尚缺乏統(tǒng)一有效的方法。 第二部分，鼻黏膜上皮細胞的培養(yǎng)和鑒定

7、。 目的：建立分離細胞培養(yǎng)方案和氣液界面培養(yǎng)法培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細胞的培養(yǎng)體系。了解不同培養(yǎng)方法對纖毛上皮的影響。 方法：取全身麻醉下鼾癥手術(shù)切取的健康下鼻甲黏膜，用含抗(氟康唑、慶大霉素)PBS溶液，在超凈臺中反復(fù)沖洗、浸泡，用0.1％膠原酶Ⅳ消化，分別接種到T25培養(yǎng)瓶進行鼻黏膜上皮分離細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)；接種到鼠尾膠原Ⅰ型包被Transwell支持膜的六孔培養(yǎng)板進行氣液界面培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察原代和傳代細胞的生長

8、情況和形態(tài)特征，行HE染色和PAS染色、免疫熒光染色、電鏡及染色體檢查。 結(jié)果：兩種方法均成功培養(yǎng)了目的細胞。其中分離細胞培養(yǎng)法得到的細胞形態(tài)學(xué)上有典型卵石樣排列，并夾雜有杯狀細胞，抗人角蛋白CK-14陽性，說明其是上皮來源。抗β—Tubulin抗體與抗FOXJ1抗體均為陽性。掃描電鏡和投射電鏡均顯示表面含有纖毛，但缺乏極性。P5代染色體檢查正常，說明傳代細胞可以保證染色體穩(wěn)定，并進行相關(guān)試驗。ALL法利用Transwell小室

9、使細胞在模擬在體條件下生長，有助于表面纖毛的分化和顆粒的分泌，并且在形態(tài)學(xué)和免疫標(biāo)志方面都得到證實。 結(jié)論：鼻黏膜細胞分離法可以得到純度較高的鼻黏膜纖毛上皮細胞。ALL法不僅創(chuàng)造了與正常組織相似的微環(huán)境，而且應(yīng)用鼠尾膠原蛋白Ⅰ型和適合氣道上皮培養(yǎng)的支氣管上皮培養(yǎng)基，是更適合纖毛分化的培養(yǎng)方法。 第三部分，臍血間充質(zhì)干細胞分化為鼻黏膜纖毛上皮的研究。 目的：探討人臍帶血間充質(zhì)干細胞在氣液界面培養(yǎng)，并用鼠尾膠原蛋白Ⅰ

10、型包被支持膜和支氣管上皮專用培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下，誘導(dǎo)分化成纖毛細胞的可能性。 方法：用rAAv2-EGFP轉(zhuǎn)染人臍帶血間充質(zhì)干細胞，用鼠尾膠原蛋白Ⅰ型包被支持膜，使用支氣管上皮細胞專用培養(yǎng)基，建立氣液界面培養(yǎng)。分別于1周和2周后收集細胞，行RT-PCR法檢測MUC8基因的表達。UCB-MSCs在膜上細胞生長2周后進行抗β—Tubulin抗體和FOXJ1免疫熒光染色。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染2小時后可見細胞發(fā)出綠色熒光。48小時消化后

11、上流式細胞儀檢測，陽性率達97.9％。RT-PCR結(jié)果顯示，UCB-MSCs不表達MUC8mRNA，鼻黏膜上皮強表達。隨誘導(dǎo)培養(yǎng)時間延長，1周時MUC8mRNA弱表達，培養(yǎng)2周后較前增強，2周時未檢測到抗β—Tubulin抗體的陽性表達，而FOXJ1于轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白背景下可觀測到紅色熒光陽性表達。在共聚焦顯微鏡的組合像中可以看到，部分標(biāo)記綠色熒光的MSCs核內(nèi)可見紅色FOXJ1陽性熒光表達。 結(jié)論：UCB-MSCs在氣液界面