兩大經(jīng)濟(jì)紅藻（紫菜和江蘺）DNA條形碼的篩選及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、我國是紫菜和江蘺養(yǎng)殖大國，同時(shí)這兩種經(jīng)濟(jì)海藻的養(yǎng)殖理論研究也居世界前列。紫菜和江蘺兩種海藻產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展需要發(fā)掘更多的種質(zhì)資源，特別是我們沒有認(rèn)識(shí)或者已經(jīng)認(rèn)識(shí)但是尚未進(jìn)一步研究和利用的海藻資源。這項(xiàng)工作的基礎(chǔ)是準(zhǔn)確的對(duì)這些資源分類鑒定。紫菜和江蘺的形態(tài)在種內(nèi)和種間有高度的可塑性，藻體形態(tài)特征易受環(huán)境因素的影響，發(fā)生不同程度地改變；其次一些親緣關(guān)系較近的物種，往往形態(tài)特征差異微弱不易鑒定或容易出錯(cuò)。因此，僅僅憑借形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行物種分類鑒

2、定，即便是受過專門訓(xùn)練的藻類學(xué)家在工作時(shí)也會(huì)遇到各種分類問題，甚至產(chǎn)生爭議。
　　本論文對(duì)紫菜和江蘺的DNA條形碼進(jìn)行了相關(guān)的研究，用于解決傳統(tǒng)分類的難題。研究從兩個(gè)方面入手，內(nèi)容包括：（1）采集紫菜和江蘺樣品，對(duì)這些樣品的COI，COX2-3，rbcL和UPA序列進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選合適的分子標(biāo)記分別作為紫菜與江蘺的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。（2）利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)采集的江蘺屬和紫菜屬海藻進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，并對(duì)傳統(tǒng)分類存在的錯(cuò)誤進(jìn)行

3、了初步的糾正。
　?。?）在江蘺屬海藻的研究中，共得到龍須菜、脆江蘺、長喙江蘺、細(xì)基江蘺繁枝變種、芋根江蘺和異枝江蘺總6個(gè)物種 COI序列長度為664bp；rbcL全長序列長度為1441 bp；UPA序列長度為410bp；另外獲得龍須菜、脆江蘺、長喙江蘺、細(xì)基江蘺繁枝變種4個(gè)物種的COX2-3序列，序列長度為339bp。其中COI、rbcL和UPA基因的擴(kuò)增效率和測(cè)序效率顯著大于 COX2-3基因。經(jīng)過K-2P遺傳距離計(jì)算，COI

4、序列的種內(nèi)變異度為0-0.02，種間變異度為0.04-0.20；COX2-3序列種內(nèi)變異度為0-0.06，種間變異度為0.08-0.32；rbcL序列種內(nèi)變異度為0-0.015，種間變異度為0.02-0.18；UPA的種內(nèi)變異度為0-0.01，種間變異度為0.02-0.11。表明四種分子標(biāo)記中，rbcL和UPA基因序列最為保守；COX2-3是變異度較大的基因序列；COI基因序列變異度比較適中，種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離。利用COI

5、序列和UPA序列作為DNA條形碼有力的輔助了江蘺屬的分類鑒定，通過序列比對(duì)和構(gòu)建的MP、ML和貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)細(xì)基江蘺、長喙江蘺和細(xì)基江蘺繁枝變種為同一物種，并嘗試重新命名為G.tenuistipitata(Chang et Xia) Ding et Li comb. nov.另外，基于四種分子鑒定結(jié)果，以及脆江蘺（G.chouae）和G.parvispora形態(tài)的相似性，初步判定它們?yōu)橥晃锓N的不同地理類群。根據(jù) UPA和COI

6、基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)龍須菜屬物種都位于系統(tǒng)樹的基部，明顯區(qū)分與江蘺屬，獨(dú)立聚為一支，支持龍須菜屬獨(dú)立于江蘺屬的系統(tǒng)分類觀點(diǎn)；而 Hydropuntia屬的物種聚在江蘺屬內(nèi)部，并未單獨(dú)聚到同一分支內(nèi)，因此 Hydropuntia屬可視為江蘺屬的以下的分類階元。另外，在利用Genbank中細(xì)基江蘺的UPA基因序列時(shí)，經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)KC478354這條序列是錯(cuò)誤的。因此，在使用 Genbank中的基因序列時(shí)需要盡可能將同一物種相關(guān)基因序列全部

7、下載，進(jìn)行比對(duì)分析，從中選取正確的序列用于實(shí)驗(yàn)研究。
　?。?）測(cè)序序列經(jīng)過拼接，最終分別得到壇紫菜、條斑紫菜、圓紫菜、Porphyra purpurea、Porphyra sp.1和Porphyra sp.2共6個(gè)物種 COI序列長度為664bp；長紫菜、縐紫菜、壇紫菜、條斑紫菜、半葉紫菜、圓紫菜、Porphyra purpurea、Porphyra sp.1、Porphyra sp.2和Porphyra sp.3共10個(gè)物種r

8、bcL和UPA全長序列，長度分別為1365 bp和410bp；另外，只獲得壇紫菜、圓紫菜、Porphyra purpurea、Porphyra sp.1和Porphyra sp.2共5個(gè)物種的COX2-3序列，序列長度為339bp。rbcL擴(kuò)增效率和測(cè)序效率最好。經(jīng)過K-2P遺傳距離計(jì)算，COI序列的種內(nèi)變異度為0-0.003，種間變異度為0.04-0.24；rbcL序列的種內(nèi)變異度為0-0.02，種間變異度為0.04-0.10；UPA

9、的種內(nèi)變異度為0-0.015，種間變異度為0.01-0.25；COX2-3基因序列信息太少，未做統(tǒng)計(jì)計(jì)算。因此可以看出，與江蘺屬不同，rbcL基因最適合作為紫菜屬DNA條形碼，COI可以作為輔助DNA條形碼。利用rbcL和COI序列對(duì)紫菜屬物種進(jìn)行物種鑒定，發(fā)現(xiàn)采自伶仃洋的兩種紫菜Porphyra sp.1和Porphyra sp.2分別為P.acanthophora和P.tanegashimensis。根據(jù) rbcL構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的