結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源多樣性及重要性狀的遺傳分析與分子標(biāo)記.pdf

1、本研究充分利用已擁有的結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源，在前期工作的基礎(chǔ)上，首先通過(guò)分子標(biāo)記的手段對(duì)涵蓋了中國(guó)各個(gè)分布和應(yīng)用區(qū)域的5種1變種共96份種源材料的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，為中國(guó)豐富的結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用及遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)目前關(guān)于結(jié)縷草屬植物抗寒性、青綠期及外部性狀遺傳基礎(chǔ)和遺傳機(jī)制的研究缺乏這一現(xiàn)狀，利用“主基因+多基因混合遺傳模型”分析方法，對(duì)結(jié)縷草屬植物重要的外部性狀(包括營(yíng)養(yǎng)性狀、生殖性狀、抗寒性、青

2、綠期)進(jìn)行遺傳分析，并通過(guò)關(guān)聯(lián)分析法對(duì)與結(jié)縷屬植物抗寒性和青綠期相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記進(jìn)行了研究，有關(guān)研究結(jié)果如下： 1、結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源多樣性研究 1.1結(jié)縷草屬植物SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用 以結(jié)縷草屬植物DNA為模板，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)法對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)反應(yīng)體系中的各個(gè)主要影響因子進(jìn)行了優(yōu)化篩選，并通過(guò)比較不同濃度的模板DNA對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的影響，確立了適合結(jié)縷草屬植物SSR-PCR反應(yīng)的最佳

3、體系.結(jié)果表明，10uL的SSR反應(yīng)體系中各組分的最適濃度分別為：10×PCR緩沖液，Mg2+2.5mmol/L，dNTP200μmol/L，正反向引物分別為0.6μmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，模板DNA的用量在30-90ng均可.并利用該優(yōu)化體系，通過(guò)30對(duì)SSR引物對(duì)包含結(jié)縷草屬植物4個(gè)種的10份材料進(jìn)行了種質(zhì)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Xgwm系列SSR引物，可以有效地用于結(jié)縷草屬植物不同種源間的鑒定及遺傳多樣性研究. 1.

4、2結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源多樣性的SSR標(biāo)記分析 通過(guò)SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)結(jié)縷草屬植物5種1變種共96份種源進(jìn)行種質(zhì)資源多樣性分析，結(jié)果表明，①結(jié)縷草屬種質(zhì)間存在豐富的遺傳多樣性，29對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出282條清晰的用于多樣性分析的譜帶，其中多態(tài)性條帶272條，多態(tài)性比率(PPB)為96.45％，Nei'S(1973)基因多樣性指數(shù)(H)為0.2203，Shannon信息指數(shù)(1)為0.3504.②應(yīng)用Nei-Li相似系數(shù)法估算了

5、96份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)，其GS在0.5922-0.9362，平均為0.7811。不同種之間，結(jié)縷草與中華結(jié)縷草、溝葉結(jié)縷草與細(xì)葉結(jié)縷草中的部分材料遺傳相似系數(shù)較高，遺傳距離較近。大穗結(jié)縷草Z010和長(zhǎng)花結(jié)縷草Z122與其它結(jié)縷草的遺傳相似系數(shù)都相對(duì)較低。同一個(gè)種內(nèi)，結(jié)縷草、中華結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草種內(nèi)遺傳變異均較大，GS分別為0.5922-0.9362，0.6879-0.9078和0.6738-0.8582。③通過(guò)分子系統(tǒng)聚類(lèi)

6、法，將96份種源分為6個(gè)大的類(lèi)群，其中第一大類(lèi)為包含結(jié)縷草、中華結(jié)縷草和少量溝葉結(jié)縷草三個(gè)種的87份種質(zhì)材料，占所有材料的90.6％。溝葉結(jié)縷草和細(xì)葉結(jié)縷草聚為一小類(lèi)。大穗結(jié)縷草Z010、長(zhǎng)花結(jié)縷草Z122、溝葉結(jié)縷草Z095以及結(jié)縷草Z115分別單獨(dú)聚為一類(lèi)。 1.3結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源多樣性的SRAP標(biāo)記分析 通過(guò)相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)結(jié)縷草屬植物5種1變種共96份種源進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果表明，

7、①結(jié)縷草屬種質(zhì)間存在豐富的遺傳多樣性，54對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出362條清晰的用于多樣性分析的譜帶，其中多態(tài)性條帶337條，多態(tài)性比率(PPB)為93.09％，Nei'S(1973)基因多樣性指數(shù)(H)為0.2409，Shannon信息指數(shù)(1)為0.3746.②應(yīng)用Nei-Li相似系數(shù)法估算了96份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)，其GS在0.5939-0.9834之間，平均為0.7588.不同種之間，結(jié)縷草與中華結(jié)縷草、溝葉結(jié)縷草與細(xì)葉

8、結(jié)縷草中的部分材料遺傳相似系數(shù)較高，遺傳距離較近，大穗結(jié)縷草Z010和長(zhǎng)花結(jié)縷草Z122與其它結(jié)縷草的遺傳相似系數(shù)都相對(duì)較低，同一個(gè)種內(nèi)，結(jié)縷草、中華結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草種內(nèi)遺傳變異均較大，GS分別為0.5994-0.9834，0.6243-0.9807和0.6630-0.9475.③通過(guò)分子系統(tǒng)聚類(lèi)法，將96份種源分為七個(gè)大的類(lèi)群，其中第一大類(lèi)和第二大類(lèi)均包含結(jié)縷草、中華結(jié)縷草和少量的溝葉結(jié)縷草種源；第三大類(lèi)群主要包括4份美國(guó)引進(jìn)的材料

9、；第四大類(lèi)主要包括溝葉結(jié)縷草和細(xì)葉結(jié)縷草；大穗結(jié)縷草Z010、長(zhǎng)花結(jié)縷草Z122和結(jié)縷草Z115都單獨(dú)聚為一類(lèi)。 1.4SSR標(biāo)記與SRAP標(biāo)記對(duì)結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源多樣性研究結(jié)果的比較 比較兩種標(biāo)記的多樣性分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記的研究結(jié)果非常一致，從聚類(lèi)結(jié)果來(lái)看，兩種標(biāo)記均表現(xiàn)為同一個(gè)種的材料基本上聚在一起，其中結(jié)縷草與中華結(jié)縷草交叉聚類(lèi)，溝葉結(jié)縷草與細(xì)葉結(jié)縷草交叉聚類(lèi)，而大穗結(jié)縷草和長(zhǎng)花結(jié)縷草單獨(dú)相聚，個(gè)別材料如結(jié)縷

10、草Z115，因具有遺傳特異性而單獨(dú)聚為一類(lèi)。對(duì)基于這兩種標(biāo)記的樣品遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，兩種標(biāo)記檢測(cè)的遺傳相似性呈極顯著的正相關(guān)(r=0.699>r0.01，n=4560)，進(jìn)一步驗(yàn)證了兩種標(biāo)記聚類(lèi)結(jié)果的相似性.兩種標(biāo)記都可以有效地用于結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源多樣性的研究中. 2、結(jié)縷草屬植物重要性狀的遺傳分析 2.1結(jié)縷草屬植物雜交后代雜種真實(shí)性鑒定 通過(guò)在抗寒性、青綠期、營(yíng)養(yǎng)性狀和生殖性狀各個(gè)

11、方面均存在差異的兩份結(jié)縷草屬種源材料，即結(jié)縷草Z136和中華結(jié)縷草Z039相互雜交，獲得正反交F1群體，擬通過(guò)所得F1群體對(duì)結(jié)縷草屬植物營(yíng)養(yǎng)性狀、生殖性狀、抗寒性和青綠期的遺傳特性作進(jìn)一步的研究，本文首先通過(guò)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)結(jié)縷草屬植物Z136×2039的184個(gè)正交后代和103個(gè)反交后代的雜種真實(shí)性進(jìn)行了鑒定，在200對(duì)SRAP引物組合中篩選出26對(duì)父本(Z039)有特異帶的引物組合，35對(duì)母本(Z136)有特異帶的引物組合，從

12、正反交父本有特異帶的引物組合中，分別選取了11對(duì)引物組合對(duì)后代真實(shí)性進(jìn)行鑒定，結(jié)果有168個(gè)正交后代和99個(gè)反交后代因具有父本的特異帶被鑒定為真雜種，其余的16個(gè)正交后代和4個(gè)反交后代因不具有父本的特異帶被認(rèn)為是自交種。雜種真實(shí)性的鑒定結(jié)果為雜交后代的進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。 2.2結(jié)縷草屬植物營(yíng)養(yǎng)性狀的遺傳分析 應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析方法對(duì)F1群體的密度、草層高度、葉長(zhǎng)、葉寬、葉長(zhǎng)/葉

13、寬、節(jié)間長(zhǎng)度、節(jié)間直徑和節(jié)間長(zhǎng)度/節(jié)間直徑進(jìn)行遺傳分析，以初步明確這些性狀的遺傳特性.結(jié)果表明：①在調(diào)查的8個(gè)性狀中，正反交雜交后代中每一個(gè)性狀的變異范圍均超出了雙親的變異范圍，變異系數(shù)不同性狀差異較大，密度的變異系數(shù)最大，其次為節(jié)間長(zhǎng)度/直徑和節(jié)間長(zhǎng)度，葉寬的變異系數(shù)最小，其它性狀的變異系數(shù)居中。②草層高度、葉長(zhǎng)、葉寬、葉長(zhǎng)/葉寬、節(jié)間直徑和節(jié)間長(zhǎng)度/直徑的正反交后代的表型值存在顯著差異，可能有母體遺傳效應(yīng)，密度和節(jié)間長(zhǎng)度正反交后代間

14、無(wú)顯著差異.③密度的最佳遺傳模型正反交均為B-1模型，即兩對(duì)主基因的加性-顯性-上位性遺傳模型，正交的主基因遺傳率為93.67％，反交的主基因遺傳率為63.22％.草層高度、葉長(zhǎng)、葉寬、葉長(zhǎng)/葉寬和節(jié)間長(zhǎng)度正反交后代群體的最佳遺傳模型均為A-0模型，即無(wú)主基因模型.節(jié)間直徑的正交為一對(duì)主基因的遺傳模型，反交為無(wú)主基因模型，節(jié)間長(zhǎng)度的正交為無(wú)主基因模型，反交為一對(duì)主基因模型。 2.3結(jié)縷草屬植物生殖性狀的遺傳分析 應(yīng)用植物

15、數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析方法對(duì)F1群體的花序密度、生殖枝高度、花序長(zhǎng)度、每穗小穗數(shù)、小穗長(zhǎng)度、小穗寬度、小穗長(zhǎng)度/寬度進(jìn)行遺傳分析，以初步明確這些性狀的遺傳特性。 2.4結(jié)縷草屬植物抗寒性的遺傳分析 通過(guò)改良電導(dǎo)率外滲法對(duì)F1群體的抗寒性進(jìn)行鑒定，并應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析方法對(duì)F1群體進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明：①正反交后代的抗寒性變異范圍均較大，正交的變異范圍為-0.3～-11.6℃，

16、反交的變異范圍為-1.7～-10.9℃，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了雙親的抗寒性(-9.1℃和-3.3℃)，正反交后代的平均值相差不大，正交后代LT50的平均值為-6.0℃，反交后代LT50的平均值為-6.3C，均間于雙親之間，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的母性遺傳現(xiàn)象.②次數(shù)分布分析結(jié)果表明，正反交F1群體的抗寒性均呈混合正態(tài)分布、表現(xiàn)出明顯的主基因+多基因的遺傳特征。③遺傳分析結(jié)果表明，結(jié)縷草屬植物的最適遺傳模型為B-4，即結(jié)縷草屬植物的抗寒性受兩對(duì)等加性的主效基

17、因控制，正反交主基因遺傳率分別為77.27％和79.60％. 2.5結(jié)縷草屬植物青綠期的遺傳分析 應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析方法對(duì)F1群體青綠期進(jìn)行遺傳分析，以初步明確結(jié)縷草屬植物青綠期的遺傳特性。 3、與結(jié)縷草屬植物抗寒性和青綠期相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記的研究 利用29對(duì)SSR引物和54對(duì)SRAP引物對(duì)96份結(jié)縷草屬植物種質(zhì)資源的基因組變異進(jìn)行擴(kuò)增掃描，共檢測(cè)到254個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)和