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文檔簡介
1、目的:腎間質纖維化是各種原因導致的終末期腎病的共同通路。最近研究表明腎小上皮細胞間充質轉變(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是腎間質纖維化中的核心事件。結締組織生長因子(ConnectiveTissueGrowthFactor,CTGF)是新近發(fā)現的一個重要的致纖維化因子。從蛋白結構看CTGF由4個不同的模塊組成,CTGF在體內以包含不同模塊的全長及不同長度的片段形式存在。人們發(fā)現CTGF具有許
2、多復雜甚或相互矛盾的作用,聯系到其多模塊的結構特點,有作者開始從結構-功能學角度來探討CTGF的作用基礎。在這些先鋒性的實驗中提示模塊4可能具有較為突出的作用。CTGF在多種慢性腎臟病中表達增高,提示CTGF與慢性腎臟病進展相關,進一步的工作發(fā)現CTGF能參與腎臟細胞的增殖、EMT及增加腎間質纖維物質堆積等多種腎臟纖維化的事件。有關CTGF在腎臟纖維化中的結構學基礎如何?是否其致纖維化效應由模塊4介導?目前尚未見報道。本研究采用重組的不
3、同片段的CTGF來直接研究CTGF在EMT中的作用及其結構基礎。 方法:人近端腎小管上皮細胞株(humanproximaltubularcellline,HPTCL)HK-2用含10%胎牛血清(fetalcalfserum,FCS)的低糖型Dulbeccos'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培養(yǎng)液培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)24小時后,用重組CTGF(C)(只包含模塊4)干預細胞,通過MTT法監(jiān)測細胞增殖指數,摸索出
4、最適濃度-時間點,用流式細胞分析技術檢測其對細胞周期的作用及抗CTGF抗體對這一作用的影響。選取50ng/mlrhCTGF(C)干預細胞0-48h,通過免疫細胞化學、Real-TimePCR觀察其對角蛋白、波形蛋白表達的影響,同時通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變,采用共聚焦顯微鏡技術觀察其對纖維連接蛋白表達的影響。在此基礎上我們還采用免疫細胞化學、Real-TimePCR技術觀察0-72hILK(integrin-linkedkina
5、se)mRNA和蛋白質表達時間效應關系;觀察不同濃度rhCTGF(C)(0-50ng/ml)作用細胞48h后,HK-2細胞ILKmRNA和蛋白質表達的濃度效應關系。同時我們還觀察了抗CTGF抗體對rhCTGF(C)的這些作用的影響以及比較了rhCTGF(N)(包含模塊1,2,3不包括模塊4)對這些指標的作用。 結果:結果顯示在50ng/ml范圍內rhCTGF(C)能促進HK-2細胞增殖,呈濃度依賴性增強(P<0.05)。在100
6、ng/ml-lug/ml濃度范圍內rhCTGF(C)呈濃度依賴性抑制HK-2細胞生長(P<0.05)。50ng/mlrhCTGF(C)作用HK-2細胞12h后即可顯著性誘使HK-2細胞增殖(P<0.05),此作用呈時間依賴性增強。rhCTGF(C)作用48h后,G0-G1期細胞減少(p<0.05),S期細胞增多(p<0.01),anti-CTGFantibody干預后能明顯減輕這一現象(P<0.05)。rhCTGF(C)可以呈時間依賴性
7、下調CK(cytokeratin)mRNA和蛋白質表達及上調VIM(vimentin)mRNA和蛋白質表達(P分別<0.05vscontrol)。RhCTGF(C)可以明顯使HK-2細胞伸長為長梭形。rhCTGF(C)可以增加FN(fibronectin)的合成,呈時間依賴性(P<0.05)。RhCTGF(C)在5ng/ml時就可以增加ILKmRNA和蛋白質表達,呈濃度依賴性(P<0.05)。RhCTGF(C)作用24h起即可上調ILK
8、mRNA和蛋白質表達(P<0.05),并呈時間依賴性。抗CTGF抗體可以阻斷這些作用(P<0.05),而rhCTGF(N)與正常對照組相比無明顯改變。 結論: 1.在一定的濃度范圍內,重組的CTGF模塊4蛋白可以促進腎小管上皮細胞的增殖,呈濃度和時間依賴性;加速腎小管上皮細胞從G1期向S期的轉變。 2.重組的CTGF模塊4蛋白可以誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT,而rhCTGF(N)未能誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。
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