氣單胞菌分子生物學檢測方法的研究和建立.pdf

1、近年來，氣單胞菌引起了人們越來越多的關注，一方面由氣單胞菌引起的疾病在不斷增多，不僅包括一些普通的腸胃感染，還包括一些腸外疾病，例如類炎性腸病和菌血癥。另一方面，對于氣單胞菌病理機制的研究也吸引了越來越多人的注意。然而，無論對于氣單胞菌的診斷還是對其病理機制的研究都要求建立一種快速檢測氣單胞菌的方法。目前對于氣單胞菌的檢測還主要采用傳統的菌種培養(yǎng)和生理生化鑒定方法，操作繁瑣復雜，檢驗周期長，交叉反應多。
　　 本課題首創(chuàng)利用環(huán)介

2、導等溫擴增技術（LAMP）檢測氣單胞菌，環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是一種新的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。它具有簡單、快速、特異性強的特點。
　　 在此課題中，我們針對氣單胞菌16S-23SrRNA基因間區(qū)（intergenic sequenceIGS）序列設計4條特

3、異性引物（兩條內引物和兩條外引物）進行LAMP擴增。為了檢測引物的特異性，127株氣單胞菌（包括18株典型菌株和109株臨床分離株）和84株臨床或分類上與氣單胞菌相似的菌株被鑒定。結果顯示LAMP具有很強的特異性，且其靈敏度可達到101CFU。我們將普通PCR和LAMP做了對照。結果顯示普通PCR的靈敏度最多可達102 CFU。此外，我們對實際糞便樣本也進行了檢測，結果顯示LAMP的檢測結果與普通PCR和生化培養(yǎng)的檢測結果是一致的。