草分枝桿菌對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥過(guò)程中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞-Th17細(xì)胞表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過(guò)檢測(cè)氣道炎癥過(guò)程中哮喘及糖皮質(zhì)激素、草分枝桿菌治療前后小鼠體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)及Th17細(xì)胞數(shù)量的改變及其細(xì)胞因子IL-10、IL-17的表達(dá)水平,分析并探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞對(duì)哮喘發(fā)病的作用機(jī)制;探討草分支桿菌對(duì)哮喘小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞/Th17細(xì)胞之間免疫平衡的影響。
　　方法：無(wú)特定病原體雌性BALB/c小鼠24只,7周齡,體重

2、約23-25克,采用隨機(jī)數(shù)字法表完全隨機(jī)平均分為4組,即正常對(duì)照組、哮喘組、地塞米松治療哮喘組、草分枝桿菌治療哮喘組。在實(shí)驗(yàn)的第1天和第14天將哮喘組、地塞米松治療哮喘組和草分枝桿菌治療哮喘組小鼠腹腔注射0.2ml卵蛋白(OVA)和氫氧化鋁(Al(OH)3)混合液[含OVA100ug,AL(OH)32mg]致敏。在實(shí)驗(yàn)的第21-25天將這三組組OVA致敏的小鼠放入自制的霧化箱內(nèi),以O(shè)VA濃度為2％的激發(fā)液向箱內(nèi)霧化,每天霧化30分鐘。地

3、塞米松治療哮喘組于每次霧化激發(fā)前30分鐘腹腔注射地塞米松,注射量為1mg/Kg,連續(xù)注射5天。草分枝桿菌治療哮喘組在實(shí)驗(yàn)的第20天,第23天,第26天腹腔注射烏體林斯,共注射三次,每次注射量均為0.57ug。在實(shí)驗(yàn)的第27-55天繼續(xù)予以O(shè)VA濃度為2％的激發(fā)液霧化,每次霧化30分鐘,每周3次。正常對(duì)照組則給予生理鹽水腹腔注射和生理鹽水霧化。所有小鼠于末次激發(fā)后24h眼球取血,引頸處死,進(jìn)行小鼠肺泡灌洗,取肺泡灌洗液備用。取小鼠左肺作病

4、理切片,觀察小鼠肺部氣道炎癥改變情況。取小鼠脾臟制備小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠CD4+T細(xì)胞亞群中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞分別所占的百分比。ELISA檢測(cè)各組小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-10、IL-17的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1)小鼠經(jīng)卵蛋白霧化激發(fā)后出現(xiàn)煩躁不安或少動(dòng)、呼吸急促甚至呼吸困難、口唇發(fā)紺、反應(yīng)遲鈍、大小便失禁等急性哮喘發(fā)作的表現(xiàn);病理檢查示:細(xì)支氣管及血管周?chē)?/p>

5、見(jiàn)明顯以嗜酸性粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞增多為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管管壁增厚,管腔狹窄,部分細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落不完整,提示小鼠哮喘模型建立成功。而經(jīng)地塞米松和草分支桿菌治療后哮喘小鼠的氣道炎癥明顯減輕。正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,無(wú)氣道炎癥的表現(xiàn)。
　　2)哮喘組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分率顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05),Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05);地塞米松治療哮喘組

6、、草分枝桿菌治療哮喘組小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分率較哮喘組小鼠明顯增加(P<0.05)、仍低于正常對(duì)照組小鼠(P<0.05),Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率較哮喘組小鼠明顯降低(P<0.05);仍高于正常對(duì)照組小鼠(P<0.05);兩種藥物治療組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3)哮喘組小鼠肺泡灌洗液、血清中IL-10水平較正常對(duì)照組明顯下降(P<0.05)、IL-17水平較正

7、常對(duì)照組明顯升高(P<0.05);地塞米松治療哮喘組、草分枝桿菌治療哮喘組肺泡灌洗液、血清中IL-10水平較哮喘組升高(P<0.05),但與正常對(duì)照組比較仍較低(P<0.05)、而IL-17水平較哮喘組有所下降(P<0.05),但與正常對(duì)照組比較仍增高(P<0.05);兩組藥物治療組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4各組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞亞群中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分率與Th17細(xì)胞百分率呈負(fù)

8、相關(guān)關(guān)系;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th17比值與肺泡灌洗液(BALF)及血清中的IL-10表達(dá)水平呈正相關(guān)、IL-17表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān);各組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中IL-10,IL-17與血清中IL-10,IL-17表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.哮喘小鼠體內(nèi)存在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目的減少和IL-10產(chǎn)生降低、Th17細(xì)胞的高表達(dá)和IL-17的產(chǎn)生增加及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th1

9、7細(xì)胞間的免疫失衡等免疫功能紊亂,是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一。
　　2.糖皮質(zhì)激素可增加 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的數(shù)目并促進(jìn) IL-10的產(chǎn)生、抑制Th17細(xì)胞的表達(dá)及IL-17的產(chǎn)生并糾正CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th17細(xì)胞間的免疫失衡狀態(tài),可能是其治療哮喘的機(jī)制之一。
　　3.草分枝桿菌作為一種免疫調(diào)節(jié)劑在干預(yù)性應(yīng)用后可通過(guò)與糖皮質(zhì)激素相似的作用機(jī)理來(lái)達(dá)到改善免疫、控制哮喘的目的,但其具體作用機(jī)制和通路尚