楊樹抗真菌病轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、木霉菌作為生物防治資源是近年來有害生物防治研究的熱點(diǎn)。美國、西歐等國家均實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)從生化和分子水平上拮抗木霉的生防機(jī)制進(jìn)行研究，并有較大的成功。關(guān)于木霉菌生防機(jī)制的假說很多，本文主要從四個(gè)方面對木霉的生防機(jī)制進(jìn)行論述：1、寄生作用與抗生作用；2、競爭作和產(chǎn)酶機(jī)制：3、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性；4、輔助機(jī)制。通過以上生防機(jī)制的闡明，以期合理地把木霉用于生防領(lǐng)域中。 幾丁質(zhì)酶是廣泛存在于微生物和

2、植物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，它能催化真菌細(xì)胞壁的重要成分一幾丁質(zhì)的水解，從而抑制真菌的生長增殖，提高植物的抗真菌能力。近年來，隨直著對其作用機(jī)理、生化性質(zhì)、表達(dá)調(diào)控的深入研究，用幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化植株正日益成為植物防御真菌病害的有效途徑。 本試驗(yàn)提取木霉 DNA，根據(jù) GENBANK上登錄的木霉幾丁質(zhì)酶基因序列設(shè)計(jì)一對引物Tri-1/Tri-2，用PCR 方法擴(kuò)增出幾丁質(zhì)酶基因片段，將PCR產(chǎn)物連接到pMDl8-T克隆載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌

3、 JM109，克隆并測序。試驗(yàn)中共得到兩個(gè)相關(guān)基因片段，測序后經(jīng)生物信息學(xué)分析確定為幾丁質(zhì)酶基因，兩個(gè)木霉菌的幾丁質(zhì)酶基因片段與已發(fā)表的序列相比其同源性達(dá)到99％。 楊樹做為廣泛栽培的重要造林樹種之一，因其速生豐產(chǎn)、實(shí)用性強(qiáng)、分布廣、無性繁殖能力強(qiáng)、基因組比較小，因此楊樹成為利用基因工程方法進(jìn)行遺傳改良的理想木本模式植物。楊樹作為轉(zhuǎn)基因的木本模式植物，主要是因?yàn)樗哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)：①分布廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高；②容易進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)，微

4、繁和再生體系已經(jīng)十分成熟；③易被土壤農(nóng)桿菌侵染，轉(zhuǎn)化率高。近年來，楊樹轉(zhuǎn)基因的研究在抗病蟲害育種、抗除草劑、材性改良、生殖發(fā)育調(diào)整以及轉(zhuǎn)基因樹的安全性等方面的進(jìn)展較快。 本研究以小黑楊作為轉(zhuǎn)基因的受體材料，研究了不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、工程菌液濃度、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間以及篩選方法對其遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。 通過不同濃度頭孢對小黑楊葉片產(chǎn)愈傷組織及分化的影響實(shí)驗(yàn)，篩選培養(yǎng)中加入700mg/L-800 mg/L 的頭孢唑林鈉濃度不會

5、影響小黑楊葉片產(chǎn)生愈傷組織和分化。加入700mg/L 的頭孢唑林鈉抑菌濃度不會影響小黑楊的誘導(dǎo)生根。 通過卡那霉素對小黑楊葉片分化和誘導(dǎo)生根所能忍受的臨界濃度實(shí)驗(yàn)，確定40mg/L 的卡那霉素作為葉片轉(zhuǎn)化篩選的臨界濃度。以20mg/L 的卡那霉素作為生根篩選的臨界濃度。 在進(jìn)行小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間以3～4d為最好。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間少于3d，抗性芽率較低，3d時(shí)的抗性芽率為 1.92％，增加到4d時(shí)達(dá)到2.08％，5d

6、以后抗性芽率下降。小黑楊轉(zhuǎn)化率并沒隨著分化率的增加而增加。菌液濃度直接影響轉(zhuǎn)化效果，適宜于小黑楊轉(zhuǎn)化的菌液液度為OD<,600>=0.3～0.4。 對于小黑楊葉片的遺傳轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)時(shí)間在2～4d時(shí)比較合適，以3d最好。侵染時(shí)間在6～15min比較適合小黑楊葉片的遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)分子檢測共獲得的13株轉(zhuǎn)基因的陽性植株，占到經(jīng)抗菌素篩選所得到的植株數(shù)的4.9％。RT-PCR 檢測表明有5株未正常表達(dá)，有可能產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象有待