小檗堿及8-羥基二氫小檗堿在小腸吸收機制的比較研究.pdf

1、小檗堿(Berberine,以下簡稱Ber)是一種異喹啉類生物堿，在臨床上用于治療胃腸炎、細菌性痢疾。十幾年來，大量研究表明，Ber能明顯減輕Ⅱ型糖尿病患者的癥狀，調(diào)節(jié)患者的血糖和血脂。然而，Ber用于降血糖時,劑量過大。對Ber進行結(jié)構(gòu)修飾，發(fā)現(xiàn)其8位羥基取代化合物（以下簡稱BerH）對Ⅱ型糖尿病模型大鼠療效均顯著優(yōu)于Ber組，且劑量較Ber低1個數(shù)量級。前期研究中采用大鼠在體灌流技術(shù)比較研究Ber與BerH在小腸吸收情況，實驗結(jié)果表

2、明：Ber引入羥基后，腸吸收量大幅度增加。Caco-2細胞模型用于研究藥物吸收轉(zhuǎn)運操作方法簡便易行,且重復(fù)性好，是目前國外廣泛采用的一種藥物腸吸收體外模型。因此，為了闡明BerH的腸道吸收機制，本課題從兩方面著手：一是根據(jù)藥典采用槳法比較研究二者的溶解及溶出性能；二是采用Caco-2細胞模型比較研究二者跨膜轉(zhuǎn)運?？缒まD(zhuǎn)運包括三個實驗內(nèi)容：時間及濃度依賴、轉(zhuǎn)運能量依賴試驗以及轉(zhuǎn)運蛋白介入試驗；采用HPLC法測定藥物含量，計算并比較跨膜轉(zhuǎn)運

3、參數(shù)表觀滲透系數(shù)Papp與外排率ER值，以期考察BerH的開發(fā)前景。主要內(nèi)容如下：
　　 1 Ber與BerH在水溶液中的溶解及溶出性能考察根據(jù)藥典采用槳法，于37℃，考察研究Ber與BerH在水溶液中的溶解及溶出性能，分別于不同時間段（15、30、45、60、90、120min）取樣，HPLC法測定藥物溶解量，并繪制溶解速率曲線及溶出度曲線。結(jié)果顯示：37℃，Ber達溶解平衡時間為30min左右，而BerH需要90min；達溶

4、解平衡時，Ber濃度在45μmol/L左右，BerH在0.35μmol/L，Ber本身已是難溶性的藥物，而由結(jié)果得知BerH的溶解速率及溶出度遠小于Ber，表明BerH極難溶于水。
　　 2 時間及濃度依賴性吸收試驗通過Caco-2細胞單層膜轉(zhuǎn)運實驗，于37℃，考察不同時間段（0.5、1.0、1.5、2.0h），不同濃度（25、50μmol/L）Ber、BerH從AP→BL及BL→AP方向跨膜轉(zhuǎn)運，AP側(cè)給藥為吸收轉(zhuǎn)運實驗,BL

5、側(cè)給藥為外流實驗，HPLC法測定二者跨膜轉(zhuǎn)運量。結(jié)果顯示：BerH高、低濃度組的雙向轉(zhuǎn)運表觀滲透系數(shù)（Papp）皆在10-5數(shù)量級，提示BerH為良好轉(zhuǎn)運的化合物；而Ber高、低濃度組皆在10-6數(shù)量級，遠小于BerH，說明BerH的膜通透性明顯高于Ber；Ber在50、25μmol/L時AP→BL方向的Papp較為接近且隨時間的延長無明顯變化；而BerH在50、25μmol/L時AP→BL方向的Papp差別較大，低濃度時的Papp是高

6、濃度時的三倍左右，說明BerH、Ber跨膜轉(zhuǎn)運都不依賴化合物的濃度，初步確定二者跨膜轉(zhuǎn)運過程為非簡單擴散，可能有載體介入轉(zhuǎn)運，但有差別。
　　 3 能量依賴性吸收試驗采用Caco-2細胞單層膜,加入ATP能量衰竭劑(迭氮鈉及脫氧葡萄糖),AP側(cè)和BL側(cè)分別給藥與取樣,HPLC法測定跨膜轉(zhuǎn)運量。結(jié)果顯示：實驗組表觀滲透系數(shù)Papp與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），迭氮鈉和2-脫氧-D-葡萄糖可抑制Ber和BerH通過Cac

7、o-2細胞單層膜的雙向轉(zhuǎn)運，表明Ber、BerH通過Caco-2細胞單層膜的雙向轉(zhuǎn)運均需要消耗能量,推測ATP結(jié)合的盒式膜轉(zhuǎn)運蛋白家族可能介入了BerH的跨膜轉(zhuǎn)運過程。
　　 4 P-gp抑制劑維拉帕米及有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑西咪替丁影響試驗采用Caco-2細胞模型，分別加入P-gp抑制劑維拉帕米及有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑西咪替丁，分別于AP和BL側(cè)給藥,考察轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對Ber、BerH跨膜轉(zhuǎn)運的影響。結(jié)果顯示：維拉帕米組

8、表觀滲透系數(shù)Papp和對照組比較差異具有顯著性（P＜0.05），維拉帕米增大BerH AP→BL方向的表觀滲透系數(shù)Papp，同時減少BerH BL→AP方向的表觀滲透系數(shù)Papp，且在60min時最為明顯；而維拉帕米僅在60min后增加Ber AP→BL方向的表觀滲透系數(shù)Papp，降低Ber BL→AP方向的表觀滲透系數(shù)Papp，且變化幅度遠小于BerH；加入西咪替丁后，Ber與BerH AP→BL方向的表觀滲透系數(shù)Papp與對照組比較

9、無顯著性差異（P>0.05），由此可推測BerH與Ber一樣，在Caco-2細胞單層膜中的轉(zhuǎn)運存在P-gp轉(zhuǎn)運蛋白的外排作用，且BerH對P－gp轉(zhuǎn)運蛋白的外排作用反應(yīng)更加敏感，但二者都不依賴有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白。
　　 綜上所述，本文通過比較研究二者在水中的溶解及溶出性能，確定了BerH溶解度及溶出速度顯著低于Ber，說明Ber結(jié)構(gòu)引入羥基后并沒有增加親水性，否定了BerH較Ber易吸收機理是因為溶解及溶出性能的增加。在此基礎(chǔ)上

10、進一步建立Caco-2細胞模型并考察比較Ber及BerH跨膜轉(zhuǎn)運性質(zhì)異同得出：二者的跨膜轉(zhuǎn)運過程均為非簡單擴散，都存在P-gp外排作用且否定BerH依賴有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白；另外，由二者的單純擴散系數(shù)比較得出BerH的膜通透性良好，遠優(yōu)于Ber，這可用于解釋前期動物模型研究中BerH腸吸收的增加；另外，相對于Ber，BerH對P-gp反應(yīng)更加敏感，這提示P-gp在BerH的腸道轉(zhuǎn)運中作用更加顯著，因此在該化合物劑型開發(fā)的過程中可考慮選擇具