人類肝素酶B細胞表位的預(yù)測和免疫原性鑒定.pdf

1、肝素酶基因是重要的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，主要分布于胎盤、脾臟、淋巴結(jié)及胸腺等免疫組織器官和細胞內(nèi)，在成熟組織無明顯表達，但其表達產(chǎn)物普遍存在于高轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞株和轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中，是破壞細胞外基質(zhì)和基底膜的必需酶。最近發(fā)現(xiàn)肝素酶抑制劑和中和抗體可有效抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，因而肝素酶被認為是目前腫瘤抗轉(zhuǎn)移治療很有希望的重要靶分子。肝素酶作為特異性腫瘤相關(guān)抗原的發(fā)現(xiàn)及其重要生物學(xué)功能的研究，為腫瘤的免疫治療奠定了良好的基礎(chǔ)。篩選和獲得優(yōu)勢抗原

2、表位是腫瘤抗原應(yīng)用于免疫治療的重要前提。隨著現(xiàn)代生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，為我們提供了一種簡單、快速的方法，即用計算機預(yù)測抗原表位。預(yù)測人類肝素酶的B細胞抗原表位，可為人類肝素酶的特異性抗體的制備提供理論支持和指導(dǎo)，但如何誘導(dǎo)高滴度的肝素酶抗體是免疫治療面臨的難題，篩選優(yōu)勢免疫表位以及優(yōu)化免疫策略是解決這一難題的根本途徑。本研究將集中探討肝素酶B細胞優(yōu)勢表位的預(yù)測、多肽設(shè)計合成、免疫策略優(yōu)化及免疫原性鑒定，以篩選和獲得其優(yōu)勢抗原表位。

3、 材料與方法: 1.以肝素酶蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用DNAStar分析軟件以及Bcepred在線二級結(jié)構(gòu)分析工具，理論預(yù)測肝素酶B細胞表位。采用Fmoc固相化學(xué)合成法，合成8分支多抗原肽(MAP)，對純化的MAP再進行高效液相色譜(HPLC)分析，再利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗測定MAP與商品化肝素酶全蛋白抗體的結(jié)合性，然后以MAP聯(lián)合或不聯(lián)合通用型T輔助表位人白細胞介素-1β線性短肽(VQGEESNDK，氨基酸163-171

4、)免疫C-57BL/6小鼠，動態(tài)檢測免疫血清效價。 2.將MAP與通用型T輔助表位人白細胞介素-1β線性短肽聯(lián)合免疫日本白毛黑眼兔，制備大量抗血清。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、Western blot及免疫組化分析，鑒定免疫血清的特異性。 結(jié)果: 1.根據(jù)DNAStar分析軟件以及Bcepred在線二級結(jié)構(gòu)分析工具綜合分析，可認為肝素酶分子大亞基第1-15(KKFKNSTYSRSSVDV)(MAP1)、279-293(

5、HCTNTDNPRYKEGDL)(MAP2)及175-189(STRPGKKVWLGETSS)(MAP3)肽段滿足親水性、可及性和可塑性，在二級結(jié)構(gòu)上位于蛋白伸展結(jié)構(gòu)或無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)內(nèi)，最可能為其優(yōu)勢B細胞表位。對純化的MAP再進行HPLC分析，顯示具有相同的保留時間，并且峰形基本單一。再利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗測定MAP與商品化肝素酶蛋白抗體的結(jié)合性，發(fā)現(xiàn)MAP2與商品化肝素酶全蛋白抗體結(jié)合性最強。以MAP聯(lián)合或不聯(lián)合通用型T輔助表位

6、人白細胞介素-1β線性短肽免疫C-57BL/6小鼠，結(jié)果動態(tài)檢測免疫血清效價，發(fā)現(xiàn)前者明顯高于后者。 2.MAP與通用型T輔助表位人白細胞介素-1β線性短肽聯(lián)合免疫日本白毛黑眼兔，制備了大量抗血清。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡及免疫組化，證實MAP1、MAP2及MAP3均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度抗體，但僅MAP1、MAP2抗體具有高特異性，MAP2抗體與肝癌組織有最強的結(jié)合能力。 結(jié)論: 1.應(yīng)用多參數(shù)法能較好預(yù)測