基因治療藥物中基因傳遞載體的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、根據(jù)自主知識產(chǎn)權(quán)的專利工藝路線，合成具有分支結(jié)構(gòu)、分子量30kD的陽離子聚合物，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建sofast基因載體，用于大分子核酸的體外和體內(nèi)的基因傳遞。通過sofast/DNA復(fù)合物形成、粒徑、zeta電位、抗核酸酶能力、酸堿緩沖能力、結(jié)合核酸能力，以及基因融合肽diINF—7和工作介質(zhì)鹽濃度的影響等分析，對sofast基因載體的轉(zhuǎn)染機制做了初步的探討。在體外試驗中，采用sofast基因載體將質(zhì)粒pEGFPN1、pCMV—lac Z和

2、 pGL3 分別轉(zhuǎn)染到HEK297細胞，通過所表達的綠色熒光蛋白、β—半乳糖苷酶和熒光素酶的檢測，證實其具有高轉(zhuǎn)染效率；通過HUV—EC等眾多細胞株的轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明其廣泛適用于眾多原代培養(yǎng)細胞和轉(zhuǎn)化細胞株的轉(zhuǎn)染；采用MTT法進行其在最高效轉(zhuǎn)染時的細胞毒性研究，結(jié)果表明細胞存活率高于90％，證實其細胞毒性極低；通過sofast 基因載體抗血清特性研究，表明其具有抗血清特性，可以直接加到細胞培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前后無需更換培養(yǎng)基，簡化轉(zhuǎn)染程序；通

3、過sofast基因載體穩(wěn)定性試驗，結(jié)果表明sofast基因載體性質(zhì)極其穩(wěn)定，適合常溫運送，4℃較長時間(3年以上)儲存。在體內(nèi)試驗研究中，急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、慢性毒性試驗、半致死量測定、過敏試驗以及熱源檢測等均表明sofast基因載體體內(nèi)應(yīng)用毒性極低，生物兼容性好；通過豚鼠尾靜脈注射sofast/pEGFPN1復(fù)合物在體內(nèi)表達試驗，結(jié)果表明sofast基因載體體內(nèi)應(yīng)用仍然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，略優(yōu)于目前市場占有率最高的陽離子脂質(zhì)

4、體Lipofectamine2000。因此，所構(gòu)建的sofast基因載體是一種高轉(zhuǎn)染效率、低細胞毒性、穩(wěn)定性好，且適用細胞類型較廣泛的基因載體，適合體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染應(yīng)用，是新一代陽離子聚合物基因載體的代表。而其簡單，快捷的試驗步驟，同樣具有很好的優(yōu)越性。 在成功構(gòu)建sofast陽離子聚合物用于大分子核酸基因傳遞基礎(chǔ)上，自主合成一帶巴西烯酸側(cè)鏈、分子量50kD的脂質(zhì)—陽離子聚合物(lipid—cationic polymer)，構(gòu)

5、建lipid—cationic polymer siRNA 基因傳遞載體，專用于體內(nèi)外小分子siRNA基因傳遞。通過lipid—cationic polymer/siRNA 復(fù)合物形成、粒徑、zeta電位、抗核酸酶能力、酸堿緩沖能力、結(jié)合核酸能力，以及基因融合肽diINF—7和質(zhì)子泵抑制劑的影響等分析，對lipid—cationic polymer 基因載體的轉(zhuǎn)染機制做了初步的探討。結(jié)果表明lipid-cationic polymer

6、以陽離子聚合物為基本骨架，在陽離子聚合物側(cè)鏈交聯(lián)上巴西烯酸，同時具備陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體的某些特性，發(fā)揮運載siRNA功能。采用lipid-cationic polymer基因載體將針對GFP的siRNA轉(zhuǎn)染到HT1080-EGFP和HeLa-EGFP 細胞，結(jié)果綠色熒光蛋白抑制率分別為73％和72％，高于lipofectamine2000的抑制率；進一步的特異性、細胞毒性、生物毒性、生物兼容性、可降解性、理化性質(zhì)穩(wěn)定性等諸多特性

7、的研究，表明所構(gòu)建的脂質(zhì)—陽離子聚合物介導(dǎo)的RNAi基因沉默技術(shù)是安全、特異和穩(wěn)定的。采用靶向環(huán)氧化酶-2(COX-2)基因的siRNA特異誘導(dǎo)COX-2基因轉(zhuǎn)錄后沉默，mRNA水平的變化提示基因載體的有效性。進一步應(yīng)用自己制備的COX-2多克隆抗體和單克隆抗體進行West-blot Test和免疫組化分析，從蛋白表達水平證實了基因載體介導(dǎo)的基因沉默是有效的。因此，lipid-cationicpolymer基因載體可作為胚胎發(fā)育、病毒感