骨髓動(dòng)員治療糖尿病大鼠后肢缺血的研究.pdf

1、目的：糖尿病能損害血管內(nèi)皮細(xì)胞從而引起微血管病變閉塞，糖尿病動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病率是非糖尿病的11倍，且周圍動(dòng)脈硬化發(fā)展快，程度重，范圍廣。由于糖尿病主要引起下肢遠(yuǎn)端微小血管的病變閉塞，常失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，易引起下肢遠(yuǎn)端缺血而致壞疽。
　　 “治療性的血管形成” 目前已被廣泛接受，已有報(bào)道采用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)基因直接注射治療糖尿病肢體缺血或者移植自體骨髓干細(xì)胞治療糖尿病肢體缺血，前者

2、由于基因治療的安全性而受到質(zhì)疑，而后者對(duì)于單純移植CD34+細(xì)胞還是多種干細(xì)胞一起移植仍在爭(zhēng)論中。本研究采用自體骨髓動(dòng)員以觀察單純骨髓動(dòng)員對(duì)糖尿病大鼠肢體缺血的作用。
　　 本研究旨在：1 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)復(fù)制動(dòng)物(SD大鼠)糖尿病模型及后肢缺血模型，通過(guò)毛細(xì)血管密度的改變觀察骨髓動(dòng)員治療糖尿病大鼠肢體缺血的療效。2通過(guò)骨髓動(dòng)員前后血CD34+細(xì)胞和白細(xì)胞的含量變化，觀察大鼠肢體急性缺血后是否存在骨髓干細(xì)胞動(dòng)員狀態(tài)。3通過(guò)內(nèi)皮功能動(dòng)

3、態(tài)的監(jiān)測(cè)，觀察骨髓動(dòng)員對(duì)糖尿病大鼠全身血管病變的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)對(duì)象SD大鼠25只，雄性，8周齡，體重180-250克之間，制備糖尿病大鼠后肢缺血模型，隨機(jī)分為2組，其中15只進(jìn)行骨髓動(dòng)員(A組)，其余10只不進(jìn)行骨髓動(dòng)員，為空白對(duì)照組(B組)。骨髓動(dòng)員后及動(dòng)員后3天從A、B兩組大鼠內(nèi)眥靜脈取血用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)WBC和CD34+細(xì)胞。骨髓動(dòng)員前及動(dòng)員后第2、4周于內(nèi)眥靜脈取血檢測(cè)ET和NO水平，動(dòng)員后第4周取雙后肢肌

4、肉做病理檢查，檢測(cè)毛細(xì)血管密度觀察骨髓動(dòng)員治療糖尿病大鼠肢體缺血的療效。
　　 1 糖尿病大鼠模型的制備
　　 大鼠禁食12小時(shí)后，按65mg/kg劑量一次性腹腔注射1[％]鏈脲佐菌素(STZ)1.5-2ml,給藥72小時(shí)后連續(xù)兩次通過(guò)尾靜脈采血，檢測(cè)空腹血糖＞16.65mmol/L作為糖尿病大鼠模型。
　　 2 糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制備
　　 麻醉大鼠后，取其雙側(cè)腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上下各行一縱行

5、缺口，分離、結(jié)扎、離斷股動(dòng)脈及其分支。觀察3天，手術(shù)后肢逐漸萎縮，活動(dòng)力下降，無(wú)壞疽，為糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制備成功。
　　 3 骨髓動(dòng)員
　　 糖尿病后肢缺血模型制備成功后，A組皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF，150ug.kg-1.d-1),同時(shí)B組每天皮下注射生理鹽水1ml/d,連續(xù)3天。繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周。
　　 4 外周血WBC和CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　 動(dòng)脈離斷術(shù)后當(dāng)天從A、B兩組

6、大鼠內(nèi)眥靜脈取血0.5ml,同法骨髓動(dòng)員3天后以上大鼠各取血0.5ml，采用Ficoll液離心制備外周血單個(gè)核細(xì)胞，F(xiàn)ITC-CD34+單抗標(biāo)記后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)WBC和CD34+細(xì)胞。
　　 5 血管內(nèi)皮功能生化指標(biāo)的測(cè)定
　　 血漿一氧化氮(NO)采用硝酸還原酶法測(cè)定，單位：umol/L。血漿內(nèi)皮素(ET)采用放射免疫分析法測(cè)定，單位：pg/ml。
　　 6 注射部位肌肉中毛細(xì)血管密度的測(cè)定
　　

7、 常規(guī)方法制備大鼠肌肉光鏡組織切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色,免疫組織化學(xué)法行CD34染色進(jìn)行毛細(xì)血管密度的測(cè)定。
　　 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)前后用配對(duì)資料t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析。顯著性用P值表示，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。
　　 結(jié)果：
　　

8、 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察
　　 雙側(cè)股動(dòng)脈離斷后3天大鼠缺血后肢逐漸萎縮，活動(dòng)力下降，所有動(dòng)物在處死取材時(shí)局部均無(wú)明顯壞疽。
　　 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)WBC和CD34+細(xì)胞結(jié)果顯示:
　　 A組動(dòng)脈切除術(shù)后當(dāng)天(n=15)WBC和CD34+細(xì)胞分別為(7.37±1.36)×109/L和(0.15±0.04)[％],動(dòng)員3天后，(n=15)WBC和CD34+細(xì)胞分別為(22.53±2.44)×109/L和(2.27±0

9、.38)[％]，明顯高于動(dòng)員前(P＜0.05)，說(shuō)明肢體缺血和G-CSF動(dòng)員能明顯提高外周血WBC和CD34+細(xì)胞含量。B組動(dòng)脈切除術(shù)后當(dāng)天(n=10)WBC和CD34+細(xì)胞分別為(7.38±1.15)×109/L和(0.16±0.05)[％]，未行動(dòng)員3天后，(n=10)WBC和CD34+細(xì)胞為(9.82±1.40)×109/L和(0.45±0.10)[％]，CD34+細(xì)胞比例明顯增高(P＜0.05)，說(shuō)明肢體缺血能明顯提高外周血WB

10、C和CD34+細(xì)胞含量。但A組比B組外周血WBC和CD34+細(xì)胞比例增幅差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明G-CSF動(dòng)員能明顯提高外周血WBC和CD34+細(xì)胞含量。
　　 3 血漿NO和ET水平的測(cè)定
　　 A組和B組動(dòng)員前NO水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，動(dòng)員后第2周、第4周A組NO水平均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。A組與B組動(dòng)員前ET水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，A組和B組各期ET

11、水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4 毛細(xì)血管密度的測(cè)定
　　 A組CD34染色陽(yáng)性的毛細(xì)血管密度為4.9±1.6個(gè)，高于B組3.7±1.8個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).
　　 結(jié)論：
　　 1大鼠肢體急性缺血后，存在骨髓干細(xì)胞動(dòng)員狀態(tài)，外周血CD34+細(xì)胞升高。
　　 2 骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑G-CSF可以明顯擴(kuò)大肢體缺血對(duì)干細(xì)胞的動(dòng)員效應(yīng)，使外周血CD34+細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于非動(dòng)