骨髓動員與動員后單個核細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠后肢缺血的療效比較.pdf

1、目的：糖尿病足發(fā)病率逐年增高，已成為非創(chuàng)傷性截肢的主要原因。其主要發(fā)病原因是下肢供血障礙，且主要為流出道閉塞，即越遠端閉塞越重，故搭橋、介入均難再通。近年來隨著干細(xì)胞研究的進展以及分離、純化干細(xì)胞方法的不斷改進，使采用干細(xì)胞治療等治療性血管生成方法在缺血部位重建有效的側(cè)支循環(huán)成為可能，并通過動物實驗驗證了將骨髓單個核細(xì)胞植入梗死部位后可促進局部的血管生成。
　　 2002年Tateishi-Yuyama等在國際首次報道了應(yīng)用骨髓

2、造血干細(xì)胞移植治療周圍血管病患者的臨床報告，接受自體骨髓單個核細(xì)胞移植治療的43例下肢動脈缺血性疾病患者均獲得了滿意的療效。2003年后國內(nèi)外應(yīng)用干細(xì)胞分離儀采集動員后的外周血干細(xì)胞移植獲得成功。
　　 2006年張楠等報道了骨髓動員在糖尿病小鼠缺血肢體新生血管形成中的作用，2007年有學(xué)者報道了內(nèi)皮祖細(xì)胞與單個核細(xì)胞移植對糖尿病大鼠血管病變療效的比較，但對骨髓動員與單個核細(xì)胞移植治療療效的比較尚未見報道。毛細(xì)血管密度改變是判斷

3、干細(xì)胞移植術(shù)療效的直觀證據(jù)和客觀指標(biāo)，為臨床提供依據(jù)。
　　 本研究旨在：1、通過動物實驗復(fù)制動物（SD大鼠）糖尿病模型及后肢缺血模型，通過毛細(xì)血管密度的改變比較骨髓動員與單個核細(xì)胞移植治療的療效。2、觀察單個核細(xì)胞移植前后毛細(xì)血管密度改變，進一步判斷其療效，為臨床提供依據(jù)。3通過內(nèi)皮動能的監(jiān)測，觀察骨髓動員與單個核細(xì)胞移植治療對糖尿病大鼠全身血管病變的影響。
　　 方法：實驗對象SD大鼠36只，雄性，8周齡，體重180

4、-250克之間，制備糖尿病大鼠后肢缺血模型，隨機選取30只大鼠進行骨髓動員，其中15只進行骨髓動員（B組），15只于動員后行單個核細(xì)胞移植（A組），其余6只為空白對照組（C組），制做雙后肢缺血模型，不進行骨髓動員及單個核細(xì)胞移植。骨髓動員前及動員后3天（移植前）、移植后第2、4周于內(nèi)眥靜脈取血檢測ET水平，單個核細(xì)胞移植后4周取雙后肢肌肉做病理檢查，檢測毛細(xì)血管密度并進行A組與B組治療效果比較。
　　 1、糖尿病大鼠模型的制備<

5、br>　　 大鼠禁食12小時后，按65mg/kg劑量一次性腹腔注射1％鏈脲佐菌素（STZ）1.5-2ml，給藥72小時后連續(xù)兩次通過尾靜脈采血，檢測空腹血糖>16.65mmol/L作為糖尿病大鼠模型。
　　 2、糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制備
　　 麻醉大鼠后，取其雙側(cè)腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上下各行一縱行缺口，分離、結(jié)扎、離斷股動脈及其分支。觀察3天，手術(shù)后肢逐漸萎縮，活動力下降，無壞疽，為糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制

6、備成功。
　　 3、骨髓動員和動員后單個核細(xì)胞的分離及移植
　　 糖尿病后肢缺血模型制備成功后，A組及B組皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF，150ug.kg-1.d-1），同時C組每天皮下注射生理鹽水1ml/d，連續(xù)3天。A組用10％水合氯醛麻醉后，心臟直接采血5ml，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×108/ml，以1ml注射器自結(jié)扎部位以下每0.5cm注射0.1ml，B組及C組

7、同法等量采血后注射等量PBS（磷酸鹽緩沖溶液），繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周。
　　 4、外周血WBC和CD34+細(xì)胞計數(shù)
　　 動脈離斷術(shù)后當(dāng)天隨機從A、B、C三組大鼠各選5只大鼠內(nèi)眥靜脈取血0.5ml，同法骨髓動員3天后以上大鼠各取血0.5ml，采用Ficoll液離心制備外周血單個核細(xì)胞，F(xiàn)ITC-CD34+單抗標(biāo)記后用流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測WBC和CD34+細(xì)胞。
　　 5、血管內(nèi)皮功能生化指標(biāo)的測定
　　 血漿內(nèi)

8、皮素（ET）采用放射免疫分析法測定，單位：pg/ml。
　　 6、注射部位肌肉中毛細(xì)血管密度的測定
　　 常規(guī)方法制備大鼠肌肉光鏡組織切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，免疫組織化學(xué)法行vWF染色進行毛細(xì)血管密度的測定。
　　 7、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較，實驗前后用配對資料t檢驗進行比較，兩組以上比較采用單因素方

9、差分析。顯著性用P值表示，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、實驗動物觀察
　　 雙側(cè)股動脈離斷后3天大鼠缺血后肢逐漸萎縮，活動力下降，所有動物在處死取材時局部均無明顯壞疽。
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測WBC和CD34+細(xì)胞結(jié)果顯示：
　　 A組動脈離斷術(shù)后當(dāng)天WBC和CD34+細(xì)胞分別為（7.37±1.36）×109/L和（0.15±0.04）％，動

10、員3天后WBC和CD34+細(xì)胞分別為（22.53±2.44）×109/L和（2.27±0.38）％，明顯高于動員前（P<0.05），B組動脈離斷術(shù)后當(dāng)天WBC和CD34+細(xì)胞分別為（7.83±1.15）×109/L和（0.15±0.05）％，動員3天后WBC和CD34+細(xì)胞分別為（23.09±2.44）×109/L和（2.29±0.36）％，明顯高于動員前（P<0.05），說明肢體缺血和G-CSF動員能明顯提高外周血WBC和CD34+細(xì)

11、胞含量。C組動脈離斷術(shù)后當(dāng)天WBC和CD34+細(xì)胞分別為（7.38±1.15）×109/L和（0.16±0.05）％，未行動員3天后WBC和CD34+細(xì)胞為（9.82±1.40）×109/L和（0.45±0.10）％，CD34+細(xì)胞比例明顯增高（P<0.05），說明肢體缺血能明顯提高外周血CD34+細(xì)胞含量。A、B兩組外周血WBC數(shù)和CD34+細(xì)胞含量均明顯高于C組（P<0.01），但A、B兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

12、　　 3、血漿ET的測定
　　 A組、B組及C組動員前ET水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），移植前（動員后3天），移植后2周，移植后4周ET水平均低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），A組和B組各期ET水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 4、毛細(xì)血管密度的測定
　　 A組和B組vWF染色陽性的毛細(xì)血管密度分別為5.8±1.9個/HP、4.9±1.6個/HP，均高于C組3.7±1.8個/HP，

13、差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），A組毛細(xì)血管密度高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）
　　 結(jié)論：
　　 1、骨髓動員和動員后單個核細(xì)胞移植均可促進缺血后肢毛細(xì)血管的生成，本研究發(fā)現(xiàn)動員后單個核細(xì)胞移植效果優(yōu)于單純骨髓動員。
　　 2、通過流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞發(fā)現(xiàn)骨髓動員能明顯提高外周血CD34+細(xì)胞含量，促進后肢毛細(xì)血管的生成。
　　 3、通過ET水平的變化發(fā)現(xiàn)骨髓動員和動員后單個核細(xì)胞