同種異體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的研究.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分： 目的：探討大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的提取、分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增的最佳條件，觀察在體外培養(yǎng)時(shí)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和生物學(xué)特性。 方法：通過密度梯度離心法從成年大鼠骨髓中分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用含15％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)擴(kuò)增；利用貼壁培養(yǎng)法分離純化，分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代擴(kuò)增，觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性。 結(jié)果：骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)4天時(shí)形成由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2、組成的細(xì)胞集落；5-12天時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，出現(xiàn)較大集落，貼壁生長(zhǎng)，成集落生長(zhǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著快于散在生長(zhǎng)的細(xì)胞；14天后，細(xì)胞融合成單層，排列成漩渦狀或放射狀。用0.25％胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，傳代細(xì)胞增殖較快，約5天可傳一代，傳至3代時(shí)細(xì)胞基本純化，但隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞增殖速度變慢并出現(xiàn)多倍體核型。 結(jié)論：經(jīng)密度梯度離心法獲取的骨髓單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)含有較多骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用貼壁培養(yǎng)方法可以對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行初步純

3、化。 第二部分： 目的：建立一種穩(wěn)定可重復(fù)的急性心肌梗死動(dòng)物模型，為后期骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植做好準(zhǔn)備。 方法：Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為2組，每組10只，經(jīng)3％戊巴比妥鈉麻醉后，實(shí)驗(yàn)組開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)，對(duì)照組僅開胸，不結(jié)扎LAD，心電監(jiān)測(cè)觀察LAD結(jié)扎前后心電圖變化，8周后行心臟超聲檢查及病理組織學(xué)檢查，檢測(cè)心梗模型制備的成功率及對(duì)心功能的影響。 結(jié)果： 1、試驗(yàn)組心電監(jiān)測(cè)術(shù)

4、后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段持續(xù)抬高>4mm。 2、術(shù)前兩組動(dòng)物心臟超聲心動(dòng)圖檢查，各項(xiàng)指標(biāo)均無差異，p>0.05。術(shù)后8周超聲心動(dòng)圖檢查顯示，心梗組收縮期與舒張期心腔內(nèi)徑與對(duì)照組相比，LVEDd增加42.9％，差別顯著(0.902±0.053 VS 0.631±0.015，p<0.001)；LVESd增加1182.5％，與對(duì)照組相比，差別顯著(0.794±0.054 VS 0.435±0.028，p<0.001)； ESAW

5、TR較對(duì)照組相應(yīng)指標(biāo)相比，顯著減低，分別為(0.085±0.042 VS 0.314±0.057，p<0.001)；而ESPWTR較對(duì)照組相應(yīng)指標(biāo)相比，則顯著增高，分別為(0.594±0.118 VS0.319±0.046，P<0.01)；心梗組與對(duì)照組LVEF相比，顯著減低，分別為(0.286±0.053 VS 0.670±0.047.p<0.001)。 3、進(jìn)行了心梗病理組織學(xué)檢查，HE染色及Masson染色顯示缺血部位心肌

6、被纖維結(jié)締組織替代，近心內(nèi)膜處殘留極少量心肌細(xì)胞，其余各層內(nèi)不含有心肌細(xì)胞，缺血部位與周圍非缺血部位的分界清晰。 結(jié)論： 1.前降支結(jié)扎可以造成大鼠前側(cè)壁及下壁大面積心肌梗死，心肌梗死后對(duì)心功能影響較大。 2.心電圖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段在LAD結(jié)扎后持續(xù)抬高>4mm，可以作為前壁大面積心肌梗死的早期判斷指標(biāo)。 3.超聲心動(dòng)圖檢查是觀察試驗(yàn)大鼠心臟形態(tài)及心功能狀態(tài)的較理想方法，方便動(dòng)態(tài)觀察，便于追蹤

7、隨訪。 第三部分： 目的：探討急性心肌梗死后骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)心功能的影響、作用機(jī)制及骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植的最佳時(shí)機(jī)。 方法：成年近交系Wistar雄性大鼠36只，體重170g-200g，隨機(jī)抽取10只為對(duì)照組(未移植細(xì)胞)，10只為心梗后立即細(xì)胞移植組，10只為心梗1周后細(xì)胞移植組，另外留取6只作為骨髓干細(xì)胞供體；截取大鼠的雙后肢，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用DAPI標(biāo)記待用，同時(shí)熒光顯微鏡下觀察DAPI的細(xì)胞標(biāo)記率

8、，留取部分標(biāo)記過的BMMNCs進(jìn)行培養(yǎng)；結(jié)扎大鼠前降支，制作心梗動(dòng)物模型，然后將已經(jīng)標(biāo)記的BMMNCs2×10<'7>個(gè)多點(diǎn)注射到梗死區(qū)域，分組同上；術(shù)后8周行超聲心動(dòng)圖檢查3組大鼠心臟功能，然后處死大鼠，熒光顯微鏡下觀察DAPI標(biāo)記的細(xì)胞，HE染色組織學(xué)檢查分析心梗局部毛細(xì)血管密度，非心梗區(qū)域心肌細(xì)胞行細(xì)胞調(diào)亡TUNEL分析。 結(jié)果： 1.骨髓單個(gè)核細(xì)胞DAPI標(biāo)記率為100％，DAPI標(biāo)記的BMMNCs體外培養(yǎng)能夠成

9、活并成功傳代。 2.術(shù)后8周超聲心動(dòng)圖檢查顯示，對(duì)照組(心梗未移植組)、心梗后即刻細(xì)胞移植組及心梗后1周細(xì)胞移植組EF值分別為(0.299±0.044 VS 0.318±0.042 VS0.591±0.092)，對(duì)照組與心梗后即刻細(xì)胞移植組相比，P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)照組及心梗后即刻細(xì)胞移植組分別與心梗后1周細(xì)胞移植組EF值比較，p值均<0.001，差別非常顯著；前壁收縮末期室壁增厚率(ESAWTR)在對(duì)照組(心梗未治療

10、組)、心梗后即刻細(xì)胞移植組及心梗后1周細(xì)胞移植組分別為(0.087±0.036VS 0.101±0.020 VS 0.114±0.020)，兩兩比較，P值均>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有增高趨勢(shì)；后壁收縮末期室壁增率(ESPWTR)在對(duì)照組(心梗未移植組)、心梗后即刻細(xì)胞移植組及心梗后1周細(xì)胞移植組分別為(0.594±0.103 VS0.542±0.092 VS 0.457±0.080)，對(duì)照組與心梗后即刻細(xì)胞移植組之間：ESPWTR比

11、較，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)照組及心梗后即刻細(xì)胞移植組與心梗后1周細(xì)胞移植組ESPWTR比較，P值均<0.05，差別顯著。 3.所有移植過BMMNCs的心臟標(biāo)本切片中未發(fā)現(xiàn)任何細(xì)胞核發(fā)DAPI的藍(lán)色熒光。 4.心梗區(qū)域毛細(xì)血管數(shù)目在對(duì)照組、心梗后即刻細(xì)胞移植組及心梗后1周細(xì)胞移植組分別為(2.14±0.62)VS(2.37±0.74)VS(7.08±1.06)，其中心梗未治療組與心梗后立刻細(xì)胞移植組比較，P>0.0

12、5，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；心梗未治療組與心梗后立刻細(xì)胞移植組分別與心梗后1周細(xì)胞移植組比較，P均<0.01，差別顯著。 5.對(duì)照組、心梗后即刻細(xì)胞移植組及心梗后1周細(xì)胞移植組非缺血區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡率分別為：(0.098±0.028)VS(0.084±0.025)vs(0.046±0.017)。其中心梗未治療組與心梗后立即細(xì)胞移植組比較，P=0.32，無顯著差異；而對(duì)照組及心梗后立即細(xì)胞移植組分別與心梗后1周細(xì)胞移植組比較，P值均顯著<

13、0.01，差別非常顯著。 結(jié)論： 1.大鼠心肌梗死1周后，骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植可以明顯改善梗死后8周大鼠的心臟功能；而大鼠急性心肌梗死后立即骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)大鼠梗死后8周的心臟功能的影響不大。 2.熒光顯微鏡檢查結(jié)果提示，心臟功能的改善與骨髓單個(gè)核細(xì)胞的橫向轉(zhuǎn)化關(guān)系不大。 3.BMMNCs移植可以增加大鼠心肌梗死后8周梗死局部的毛細(xì)血管密度，減少心肌細(xì)胞的調(diào)亡，梗死局部的毛細(xì)血管密度的增加及心肌細(xì)胞調(diào)亡