心內(nèi)膜下移植骨髓單個(gè)核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞對豬急性心肌梗死療效的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　心肌梗死發(fā)生后,由于心臟的再生能力極其有限,靠心肌自身的修復(fù)機(jī)制遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能彌補(bǔ)因缺血損傷造成的心肌細(xì)胞的損失,殘存心肌的代償性肥大以及梗死心肌的纖維化使許多患者最終不可避免的發(fā)展成為心力衰竭。藥物治療和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)的飛速發(fā)展雖然有效降低了心肌梗死病人的早期死亡率,改善了患者的生活質(zhì)量,卻不能從根本上解決心肌細(xì)胞損失的問題,因此很多病人的預(yù)后并不理想。心臟移植作為一種終末治療手段,也受到免疫排斥、供體不足、高死亡率、

2、費(fèi)用昂貴等諸多因素的限制。
　　干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始的未分化細(xì)胞,是形成哺乳類動(dòng)物各組織器官的原始細(xì)胞,它的出現(xiàn)為心肌損傷的治療帶來了新的希望。目前干細(xì)胞心肌再生研究已經(jīng)成為探討心肌損傷治療策略的熱點(diǎn)。研究表明,干細(xì)胞可以通過多種方式發(fā)揮修復(fù)損傷心肌的治療作用。對多種干細(xì)胞的基礎(chǔ)、臨床前及臨床研究已經(jīng)證實(shí)了干細(xì)胞治療對心臟損傷的安全性和有效性,其中部分已經(jīng)完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)。
　　但干細(xì)胞治療仍然

3、有許多問題未解決,如機(jī)制還不十分明確,細(xì)胞在體內(nèi)的存留和植入效率極低,最佳細(xì)胞類型、最佳細(xì)胞劑量、最佳輸注途徑及最佳輸注時(shí)機(jī)等仍不清楚,而最直接、首先需要解決的問題則是選擇合適的細(xì)胞類型,以最佳途徑輸送到目標(biāo)區(qū)域,由于各個(gè)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作技術(shù)存在很大差別,使不同種類細(xì)胞之間的療效的比較十分困難,因此,我們設(shè)計(jì)了這個(gè)實(shí)驗(yàn),對骨髓單個(gè)核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(Mes

4、enchymal stem cells,MSCs)對急性心肌梗死的療效進(jìn)行頭對頭的比較。
　　目的：
　　1、探索經(jīng)皮心內(nèi)膜下心肌注射技術(shù)治療大動(dòng)物急性心肌梗死方法;
　　2、比較心肌內(nèi)BMMNCs和MSCs的移植,對大動(dòng)物急性心肌梗死的療效;
　　3、進(jìn)一步觀察BMMNCs和MSCs在治療大動(dòng)物急性心肌梗死中可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)用小型豬髂后上嵴穿刺抽取骨髓,密度梯度離心法分離單個(gè)核

5、細(xì)胞,再體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和多向分化能力對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,應(yīng)用CM-DiI及GFP分別對骨髓單個(gè)核細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記;
　　2、30只實(shí)驗(yàn)用小型豬隨機(jī)分為3組,每組10只。通過臨床心導(dǎo)管技術(shù),應(yīng)用球囊封堵小型豬左冠狀動(dòng)脈前降支建立小型豬急性心肌梗死模型;
　　3、制備模型2周后,將標(biāo)記過的骨髓單個(gè)核細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及培養(yǎng)液通過心肌注射器經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行心內(nèi)膜下心肌內(nèi)注射;
　　4、通過經(jīng)胸超

6、聲心動(dòng)圖及SPECT對小型豬細(xì)胞治療后的心臟功能及組織灌注進(jìn)行觀察,隨訪8周;
　　5、心肌梗死10周后處死動(dòng)物,取組織熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的植入,免疫熒光染色檢測植入細(xì)胞的分化;
　　6、CD31免疫熒光染色觀察梗死心肌的新生血管;
　　7、天狼星紅染色并偏振光顯微鏡下觀察心肌纖維化及膠原形成情況;
　　8、Western-Blot檢測梗死心肌內(nèi)的MMP表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、成功從小型豬骨

7、髓中分離培養(yǎng)出了豬骨髓單個(gè)核細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞,并進(jìn)行了鑒定及熒光標(biāo)記;
　　2、共計(jì)30只小型豬接受模型制備,制備過程中死亡8只,其余22只均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,并接受了細(xì)胞或培養(yǎng)液注射及超聲心動(dòng)圖和SPECT檢查;其中MSCs組8只,其余兩組每組7只;
　　3、10周時(shí),經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示,三組之間的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室收縮末容積(LVESV)、左室舒張末容積(LVEDV)均無明顯差異(LVEF:MSCs組51

8、±8.3％,BMMNCs組50±6.2%,CON組48±7.3%,p>0.05),與細(xì)胞注射前相比,MSCs組及BMMNCs組的LVEF雖然有所增加,但差異不具有顯著性(p>0.05)。心梗10周時(shí),MSCs組的室壁運(yùn)動(dòng)分?jǐn)?shù)(WMSI)較2周時(shí)明顯改善(1.96±0.24 vs2.35±0.21,p<0.05),而BMMNCs組及CON組則無明顯改善。10周時(shí)三組之間的WMSI無明顯差異(p>0.05)。心梗10周時(shí),僅MSCs組的室壁

9、增厚率(WT%)較2周時(shí)明顯改善(27±4.4%vs18±3.7%,p<0.05),且10周時(shí)MSCs組的WT%明顯優(yōu)于BMMNCs組及CON組(27±4.4%vs20±2.1%,18±2.9%,p<0.05);
　　4、10周時(shí),SPECT結(jié)果顯示,細(xì)胞移植8周即心肌梗死10周后,CON組的灌注缺損沒有明顯改變,MSCs及BMMNCs治療均顯著減小了梗死心臟的灌注缺損(MSCs:21.7±3.0%vs29.6±5.1%,p<0.

10、05;BMMNCs:22.9±3.7%vs29.4±5.6%,p<0.05)。且心梗10周時(shí)MSCs及BMMNCs治療組的灌注缺損顯著小于CON組(21.7±3.0%,22.9±3.7%vs30.0±5.8%,p<0.05)。MSCs組及BMMNCs組治療后灌注缺損的絕對改變也顯著優(yōu)于 CON組(-8.0±2.5%,-6.5±1.9% vs.-2.0±1.3%,p<0.05);
　　5、組織CD31免疫熒光染色結(jié)果顯示,10周時(shí),

11、 MSCs組及BMMNCs組心臟梗死周邊組織的新生血管密度明顯高于CON組(16.2±4.1%,14.0±3.4%vs.7.8±2.8%,p<0.05);
　　6、組織天狼星紅染色及偏振光顯微鏡檢查結(jié)果顯示,MSCs組的缺血區(qū)組織內(nèi)膠原含量明顯低于BMMNCs組和CON組(55.4±6.5% vs63.6±7.8%,67.4±7.2%,p<0.05);
　　7、Western-Blot檢測結(jié)果顯示,MSCs組梗死周圍組織內(nèi)的

12、MMP-2表達(dá)水平明顯低于BMMNCs組和CON組(p<0.05),三組的MMP-9表達(dá)水平無明顯差異。
　　結(jié)論
　　1、本實(shí)驗(yàn)建立了經(jīng)皮心內(nèi)膜下心肌內(nèi)注射干細(xì)胞,治療大動(dòng)物心肌梗死的方法,確認(rèn)了其可行性;
　　2、發(fā)現(xiàn)BMMNCs和MSCs均可改善心肌灌注,相比BMMNCs,MSCs可提高左室局部收縮功能;
　　3、MSCs對心肌損傷的修復(fù)作用優(yōu)于BMMNCs,治療效果的差異可能與MSC抑制梗死后心肌的纖維化