阿托伐他汀改善骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療急性心肌梗死療效的實驗研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是移植治療急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)理想的供體細胞之一，但AMI后局部惡劣的微環(huán)境不利于移植細胞存活并發(fā)揮作用，以致治療效果受限。本課題組前期研究已證實他汀類藥物可通過改良心肌微環(huán)境提高MSCs移植療效，但具體機制不清。AMP蛋白激酶(AMPK)途徑、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B

2、(PI3K/Akt)途徑和一氧化氮合酶(NOS)/一氧化氮(NO)系統(tǒng)在他汀類藥物的作用機制中占重要地位。本課題旨在研究阿托伐他汀(Atorvastatin，Ator)對體外缺氧無血清條件下培養(yǎng)的豬骨髓MSCs的影響及其作用途徑與機制。
　　 方法：豬骨髓MSCs分正常對照組、缺氧/無血清對照組、不同濃度梯度（0.001μM-10μM）Ator處理組、AMPK通路抑制劑Compound C(10mM)組，PI3K通路拮抗劑LY2

3、94002(50μM)組。流式細胞儀檢測各組間MSCs的凋亡比例，Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2水平及AMPK、Akt、eNOS磷酸化水平，RealTime-PCR檢測AMPK、Akt和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的基因表達水平。結(jié)果：Ator(0.001μM-10μM)可抑制缺氧/無血清條件誘導(dǎo)的MSCs凋亡，該效應(yīng)不能被PI3k通路阻斷劑LY294002抑制，但可被AMPK通路阻斷劑Compound

4、C抑制，Ator干預(yù)后凋亡蛋白Bax表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加。AMPK、Akt和eNOS基因表達增加，且AMPK和eNOS磷酸化水平提高，二者間存在顯著相關(guān)性(r=0.599，P=0.004)，該效應(yīng)同樣可被Compound C抑制。
　　 結(jié)論：Ator可抑制缺血/無血清條件誘導(dǎo)的豬骨髓MSCs凋亡，該效應(yīng)主要與AMPK通路介導(dǎo)的eNOS活化有關(guān)，本實驗條件下PI3K/Akt通路在其中的作用仍不確定。
　　

5、 第二部分：
　　 目的：在本課題組前期研究基礎(chǔ)上，進一步驗證阿托伐他汀(Atorvastatin，Ator)對豬自體骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植治療急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）療效的影響，并通過一氧化氮合酶阻斷劑N-硝基-左旋精氨酸(L-NNA)評價一氧化氮合酶/一氧化氮(NOS/NO)系統(tǒng)在其中的作用，以明確他汀改良梗死微環(huán)境進

6、而提高干細胞移植療效的分子機制。
　　 方法：42只中華小型豬分為6組(n=7)：假手術(shù)組(Sham)、AMI對照組(AMI)、單純Ator干預(yù)組(Ator)、單純MSCs移植組(MSCs)、Ator+MSCs移植組（Ator+MSCs）、Ator+MSCs移植+L-NNA組（Ator+MSCs+L-NNA）。通過開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支90分鐘建立AMI/再灌注模型，再灌注后30分鐘于梗死周邊心肌內(nèi)注射DAPI/DiI標記的自

7、體骨髓MSCs（3×107細胞，1mL），對照組以相同方法注射等體積DMEM培養(yǎng)基。Ator干預(yù)組動物在造模前3天至術(shù)后28天口服Ator(0.25mg/kg·d)，加用L-NNA動物同時口服L-NNA(5mg/kg·d)。喂藥前（基線）及處死前（終點）取外周血檢測血脂、高敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)、NO濃度及結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)活力。在1周（基線）及4周（終點）時行單光子發(fā)射計算機斷層顯像(SPECT)/正電子發(fā)射計算機斷層顯像

8、，計算機輔助斷層顯像(PET-CT)檢測梗死面積及存活心肌，核磁共振成像(MRI)檢測心功能，組織H&E染色和Masson’sTrichrome染色觀察梗死面積、炎癥細胞浸潤及心肌纖維化情況，TUNEL法檢測梗死周邊組織細胞凋亡指數(shù)，免疫熒光檢測標記的移植細胞在體存活和心肌特異性肌鈣蛋白-T(CTn-T)和縫隙連接蛋白-43(Cx-43)表達情況。
　　 結(jié)果：各組動物基線和終點血脂水平均無顯著差異（P＞0.05）。終點時Ato

9、r+MSCs組Hs-CRP降低最顯著（-0.23±0.007μg/L，P=0.0002），且cNOS活力顯著提高(18.32±3.89U/mL，P=0.001)。SPECT及PET-CT掃描顯示，基線時各組梗死面積無顯著差異（P＞0.05）．終點時Ator+MSCs組梗死面積及其比例改善最為顯著(-7.00±3.16cm3，P=0.0001：-3.00±1.14％，P=0.0004)，存活心肌顯著增多(SUV,3.42±1.16，P=0

10、.043)。而MSCs或Ator組梗死面積和存活心肌改善均不顯著。MRI顯示各組動物心功能參數(shù)在基線時無顯著差異（P＞0.05），終點時單純MSCs移植或Ator處理組與對照組相比各項心功能參數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。Ator+MSCs組左室射血分數(shù)(LVEF)、左室心輸出量(LVCO)和左室心臟指數(shù)(LVCI)均顯著升高(14.22±12.85%,P=0.019；0.70±0.45L/min,P=0.036；0.80±0.49L

11、/min·m2,P=0.013),而加用L-NNA后可抵消這種改善效應(yīng)。組織病理學(xué)染色顯示對照組梗死區(qū)呈連續(xù)性大片狀纖維化，有較多炎性細胞浸潤，正常心肌細胞少見。MSCs組和Ator組相似，梗死區(qū)纖維化和炎性細胞浸潤稍輕，有少量正常心肌細胞。Ator+MSCs組炎癥細胞浸潤顯著減輕，正常心肌細胞較多，纖維化呈散在分布，梗死周邊區(qū)域凋亡指數(shù)降低最顯著(2.8±0.8%，P＜0.05)。Ator+MSCs組移植細胞在體存活比例最高(88.1