急性心肌梗死后冠脈內(nèi)移植自體骨髓單個核細胞與間充質(zhì)干細胞對心臟結構和功能的影響.pdf

1、目的：急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)是嚴重危害人類健康的常見多發(fā)病之一。由于AMI后壞死心肌細胞收縮功能的丟失，AMI發(fā)展到末期往往導致心力衰竭。雖然溶栓、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(PTCA)、激光心肌血運重建術(TMR)、冠狀動脈旁路移植術(CABG)等治療措施能夠減少壞死心肌數(shù)量及減小梗死面積，但不能逆轉壞死的心肌。近年有研究證明心肌梗死區(qū)周圍的心肌細胞雖可以發(fā)生分裂，但修復梗死心肌的能力有

2、限。目前，人們針對其病理生理機制提出了細胞水平心肌成形術(cellularcardiomyoplasty，CCM)，即用細胞移植的手段增加心肌細胞的數(shù)量，修復壞死的心肌，從而改善心功能，降低病死率，為MI的治療提供了一種新思路。由于骨髓干細胞取材相對方便，不存在倫理問題，自體移植不存在免疫排斥反應，因而成為再生心肌的首選細胞供體。骨髓干細胞的組成很復雜，包括骨髓問充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)、造血干細

3、胞(Hematopoieticstemcells，HSCs)、內(nèi)皮祖細胞(Endothelialprogenitorcells，EPCs)、多潛能成體祖細胞(Multipotentadultprogenitorcells，MAPCs)以及其他功能不明的干細胞。由于分離和純化方法不同，又可分為骨髓單個核細胞群(Bonemarrowmononuclearcells，BM-MNCs)、AC133陽性細胞、邊緣細胞群(Sidepopulatio

4、ncells，SP細胞)、Lin-、c-kit+細胞和各種單克隆干細胞等。BM-MNCs是抽得骨髓利用淋巴分離液(percoll液)經(jīng)過梯度密度離心法得到的多個單核細胞混合。集成了所有的骨髓干細胞成分。MSCs存在于全身結締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓問充質(zhì)中含量最為豐富，具有貼壁生長性、非吞噬性、成纖維細胞樣和克隆性生長等生物特性。目前認為干細胞移植對于心肌梗死有一定的治療作用，但對于二者治療心梗的比較研究卻很少。本研究擬用實驗動物豬建立

5、AMI模型，抽取骨髓，分離得到BM-MNCs，并加以培養(yǎng)獲得MSCs，使用誘導劑促其向心肌細胞分化。使用冠脈介入的方法將BM-MNCs及誘導的MSCs移植入心梗部位。比較二者對實驗動物心臟結構和功能的改變，探討冠脈內(nèi)移植誘導的MSCs能否進一步改善心肌梗死后短期內(nèi)心臟的結構和功能，為今后的臨床治療提供依據(jù)。 方法：選擇36只8～12個月齡的小型豬為實驗對象。隨機分為三組：骨髓單個核細胞移植組(BM-MNCs移植組)、經(jīng)誘導骨髓間

6、充質(zhì)干細胞移植組(MSCs移植組)、對照組每組12只。 術前抽取BM-MNCs移植組及MSCs移植組實驗用豬的骨髓，分離獲得BM-MNCs。MSCs移植組先將骨髓單個核細胞篩選、分離、培養(yǎng)獲得MSCs，培養(yǎng)至第2代時加用5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-AZA)誘導培養(yǎng)24h。移植術前均使用膠體金標記。 麻醉后，使用穿刺或切開直視穿刺方法在股動脈或頸外動脈置入鞘管，行冠脈造影，于前降支的第一對角支以遠使用球囊

7、阻斷血流，制作AMI模型。60分鐘后撤去球囊恢復血流。BM-MNCs移植組使用over-the-wire(OTW)球囊于前位置阻斷血流后，注入骨髓單個核細胞。MSCs移植組以相同方法建立心梗模型并移植誘導培養(yǎng)的MSCs。對照組在制成心梗模型后用同樣方法注入等量培養(yǎng)基。 分別于制模前及術4周后行超聲心動圖檢查，探測左心室舒張期末直徑(LVEDd)和收縮期末直徑(LVEDs)，并計算左心室短軸縮短率(FS)，采用Simpson法測量

8、并計算左心室射血分數(shù)(LVEF)作為心臟收縮功能的指標。同時探測主動脈(AO)寬度，舒張末期室間隔厚度(IVS)，左房內(nèi)徑(LA),左室后壁厚度(LVPW)以及LVEDd和LVEDs作為心臟結構改變的指標。使用16節(jié)段分段法計算室壁節(jié)段運動指數(shù)(WMSI)。 細胞移植術后4周處死實驗動物，取心臟標本，觀察室壁瘤出現(xiàn)情況，分別于梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及正常區(qū)域取得心肌標本，分別用于光鏡檢查及透射電鏡檢查。光鏡標本固定、包埋、切片并行H

9、E染色，每張HE切片隨機取8個視野，計算每高倍鏡(×400)視野的毛細血管數(shù)的總量，每個樣本觀察5張切片，取平均值。透射電鏡觀察膠體金標記的移植細胞的存活、分化情況。 所有數(shù)據(jù)輸入SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標準差表示；組內(nèi)造模前后自身對照使用配對T檢驗；組問使用單因素方差分析，如有統(tǒng)計學差異則進行兩兩比較的q檢驗；檢驗水準以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1造模結果27只實驗動

10、物存活。術后心電圖及心肌鈣蛋白I證實心梗模型制作成功。 2超聲心動圖結果 2.1術前BM-MNCs移植組、MSCs移植組及對照組的LVEF分別為(64.81±4.69％；60.86±6.04％；64.28±4.17％)，F(xiàn)S分別為(34.79±3.44％；31.59±4.72％；34.47±3.19％)，三組之間差異無統(tǒng)計學意義(P分別為0.2064和0.1659)。術后4周，三組LVEF分別為(58.52±4.86％；

11、56.55±5.45％；46.46±9.84％)，F(xiàn)S分別為(30.27±3.17％；28.92±3.48％；23.18±6.00％)三組間差別有統(tǒng)計學意義(P分別為0.0031和0.0058)，兩移植組均高于對照組。BM-MNCs移植組LVEF、FS略高于MSCs移植組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與術前相比，三組術后4周LVEF、FS均下降，差別有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。 2.2三組問AO、LA、LVEDd及L

12、VEDs術前均無差異(P均＞0.05)，術后4周較術前均有不同程度的增加，對照組的LA、LVEDd及LVEDs擴張較兩移植組大，差異有統(tǒng)計學意義，P值分別為0.0351；0.0023和0.0001；AO無差異(P=0.1522)；三組IVS和LVPW術后4周均較術前減小，其中IVS差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0404)，對照組比移植組變薄更顯著；LVPW差異無統(tǒng)計學意義(P=0.1763)。BM-MNCs移植組與MSCs移植組之間差別均無

13、統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與術前相比，BM-MNCs移植組的LA及對照組的LA、IVS、LVEDd及LVEDs差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。 2.3WMSI結果顯示：兩移植組指數(shù)均小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0278)。兩移植組間無差異(P＞0.05)。3組織學結果HE染色切片顯示心梗區(qū)心肌為纖維組織所代替，其間殘存少量心肌，BM-MNCs移植組切片中出現(xiàn)鈣化灶。血管密度顯示，兩移植組的梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及正常

14、心肌區(qū)中毛細血管數(shù)量明顯高于對照組(P均＜0.05)，而兩移植組間則未見差異(P＞0.05)。透射電鏡下MSCs移植組觀察到胞質(zhì)內(nèi)含有膠體金的不成熟心肌細胞。 結論： 1介入冠脈內(nèi)自體干細胞移植治療急性心肌梗死在方法上是可行的。 2AMI再通血管后給予BM-MNCs及MSCs在冠脈內(nèi)移植，對于梗死心臟的收縮功能有改善作用。并能減緩左室重構進程，減輕心室擴張。但在心梗后短期(4周)二者治療效果無顯著差異 3