細辛含藥血清對SD大鼠延髓背側(cè)呼吸神經(jīng)元I-,K-的影響.pdf

1、目的：細辛系馬兜鈴科多年生草本植物，是臨床常用中藥。關(guān)于細辛的毒性和劑量問題，素有爭論，極大地限制了細辛的臨床應(yīng)用和療效的發(fā)揮。隨著血清藥理學(xué)和膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)，中藥及其復(fù)方的藥理學(xué)研究開辟了新紀(jì)元。本課題采用血清藥理學(xué)和膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的實驗方法觀察細辛含藥血清對大鼠延髓背側(cè)呼吸組(dorsa，lrespiratorygroup，DRG)呼吸神經(jīng)元鉀離子通道的影響。為深入探討細辛對呼吸中樞抑制的機制，從分子神經(jīng)生物學(xué)水平提供實驗資料。

2、 方法：1 細辛含藥血清的制備北細辛干燥根莖置于電熱干燥箱中(40℃)干燥1h，經(jīng)粉碎機粉碎，過5號篩(80目)，得細辛散劑，密封瓶中保存?zhèn)溆?。成年SD大鼠隨機分為空白血清組、細辛含藥血清組，其中細辛含藥血清組的細辛灌胃劑量根據(jù)《中國藥典》(2005版·一部)中對臨床用細辛劑量的規(guī)定(1～3g)取其中間劑量2g，依據(jù)人與大鼠體表面積換算，給藥劑量為其等效劑量的10倍，計算為1.78g/kg；空白血清組給予等量生理鹽水。每日1次，

3、連續(xù)8d，末次灌胃2h后固定大鼠，眼眶采血。室溫下靜置30min后取上清液，2500rpm離心25min，分離血清。分離的血清置于56℃水浴30min滅活，過0.22μm微孔濾膜濾過除菌，分裝，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩? 細辛含藥血清對SD大鼠DRG呼吸神經(jīng)元延遲外向整流鉀通道電流(delayed outward potassium current，I<,K>)的影響新生1～3d的SD大鼠快速斷頭取腦，置于0～4℃充氧(95％O<,2>

4、+5％CO<,2>)的人工腦脊液(artificial cerebrospinal solution，ACSF)中，置于冰袋上分離延髓。振動切片機將延髓切成400～500μm厚的腦片，針頭分離DRG，放入通氧、32℃的ACSF中，恒溫水浴平衡60min。60min孵育結(jié)束后將腦片置于 0.25％胰蛋白酶消化液中，32℃孵育消化15min，后用 ACSF 將酶液洗去，依次用尖端熱拋光處理的500μm、300μm、150μm Pastuer

5、 管吹打，直到?jīng)]有明顯的組織塊為止。懸浮液靜置5min后，吸取中層細胞懸液，滴加到清潔的載玻片上，靜置5～10min待細胞貼壁后放入裝有1.5～2mlACSF的玻璃培養(yǎng)皿(直徑 35 mm)中進行膜片鉗全細胞記錄。將神經(jīng)元鉗制在-50mV，給予步幅10 mV、時程為 120ms 的階躍方波刺激，記錄從-50mV去極化到+30mV時激活的電流，待細胞電流穩(wěn)定后，將多排管微量加藥系統(tǒng)置于神經(jīng)元周圍，給藥管口距記錄細胞約100μm左右，石英加

6、藥管內(nèi)徑約為220μm。在系統(tǒng)中分別加入細胞外液、10％空白血清和10％細辛含藥血清，在相應(yīng)藥液加入5min后將細胞鉗制在-50mV，給予-50mV至+30mV步幅10mV、時程為120ms的階躍方波刺激，分別記錄正常細胞外液、10％空白血清和10％細辛含藥血清鉀電流的變化并繪制電流-電壓關(guān)系曲線(Ⅰ-Ⅴ曲線)。 結(jié)果：實驗結(jié)果表明，在電壓相同情況下的I<,k>峰值，空白血清組與空白對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，含藥血

7、清組與空白血清組相比有顯著性差異(P<0.05)，含藥血清組與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。說明10％細辛含藥血清可激活延遲外向整流鉀通道(Delayed outward potassium channel，Kv)。而空白血清組對Kv無影響，故可消除血清中其他成分對Kv的影響。 結(jié)論：1.細辛含藥血清對大鼠DRG呼吸神經(jīng)元的Kv有明顯激活作用。2.細辛含藥血清對大鼠 DRG 呼吸神經(jīng)元Kv的生物特性無明顯影響。3.