菟絲子含藥血清對大鼠胚胎肢芽發(fā)育的影響.pdf

1、目的:探討菟絲子含藥血清對SD大鼠胚胎肢芽發(fā)育的影響。
　　 方法:
　　 1.采用中藥血清藥理學方法制備菟絲子含藥血清。選取24只SD雄鼠隨機分為實驗3組和陰性對照組,每組6只。實驗組每日按照40g/kg、20g/kg、10g/kgBW灌胃,分別制備高、中、低劑量菟絲子含藥血清,陰性對照組采用蒸餾水(1ml/100gBW)灌胃后制備正常血清。
　　 2.大鼠胚胎前肢芽器官培養(yǎng):取大鼠E15前肢芽,隨機分為3個實

2、驗組、陰性對照組和陽性對照組。實驗組分別加入培養(yǎng)體積10％的高、中、低劑量菟絲子含藥血清,陰性對照組加入正常血清,陽性對照組加入全反式維甲酸溶液。體外培養(yǎng)72h后收獲肢芽,進行如下檢測:(1)每組取12個肢芽,石蠟包埋、切片、HE染色觀察肢芽器官發(fā)育分化情況。(2)取38個肢芽/組,阿利新蘭染色后利用Neubert評分系統(tǒng)對軟骨發(fā)育分化情況進行評分。(3)每組取30個肢芽,測量肢芽長度。
　　 3.大鼠胚胎后肢芽細胞微團培養(yǎng):取

3、大鼠E15后肢芽,制成肢芽細胞懸液。接種于細胞培養(yǎng)板中,如器官培養(yǎng)法分組加受試物。培養(yǎng)72h后收獲肢芽細胞,進行如下檢測:(1)肢芽細胞的增殖和分化情況:MTT法檢測增殖情況,阿利新蘭染色后通過軟骨細胞集落數(shù)檢測分化情況。(2) RT-PCR法檢測各組肢芽細胞BMP-2、CollagenⅡ mRNA的表達水平。(3) Western Blot法檢測各組肢芽細胞CollagenⅡ蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果:1.菟絲子含藥血清對S

4、D大鼠前肢芽器官的影響
　　 (1)經(jīng)HE染色后,各組前肢芽均可見肩胛骨、肱骨、尺骨、橈骨、掌骨的軟骨,未見腕骨。菟絲子含藥血清低、中劑量組的肢芽和陰性對照組肢芽的結(jié)構(gòu)一樣,細胞排列整齊,軟骨輪廓清晰,指突明顯,結(jié)構(gòu)完整。高劑量組細胞排列整齊,軟骨出現(xiàn),輪廓較清晰,但指突不如陰性對照組的明顯。
　　 (2)經(jīng)阿利新蘭染色后,各組前肢芽長骨均清晰可見,未見腕骨,掌指骨尚未發(fā)育完善。陽性對照組掌指骨發(fā)育分化最差,Neuber

5、t評分最低,與陰性對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。菟絲子含藥血清低劑量和中劑量組掌指骨發(fā)育分化好,Neubert評分高,與陰性對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。高劑量組肢芽掌指骨發(fā)育分化較差,與陰性對照比較具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 (3)各組前肢芽分段測量后,加藥組前肢芽肩與腕之間A段長度、腕與指末端之間B段長度均小于陰性對照組,與之比較具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 2.菟絲子含藥

6、血清對SD大鼠胚胎肢芽細胞的影響:
　　 (1)菟絲子含藥血清對肢芽細胞增殖和分化情況:實驗組均促進了肢芽細胞增殖,其中低和中劑量組數(shù)據(jù)與陰性對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。中劑量組所形成的軟骨細胞集落數(shù)最多,與陰性對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。而高劑量組所形成的集落數(shù)少,與陰性對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 (2)菟絲子含藥血清對肢芽細胞中BMP-2mRNA表達的影響:低和中劑量

7、組BMP-2 mRNA的表達水平高,與陰性對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。高劑量組BMP-2 mRNA的表達水平低,與陰性對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 (3)菟絲子含藥血清對肢芽細胞中CollagenⅡ mRNA和蛋白表達的影響:實驗組CollagenⅡ mRNA和蛋白的表達水平均較高,與陰性對照組比較均具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.各劑量菟絲子含藥血清對S

8、D大鼠前肢芽整體總長度的發(fā)育均具有一定影響,其中高劑量的抑制效果明顯。低、中劑量菟絲子含藥血清對前肢芽中軟骨的形成無影響,而高劑量菟絲子含藥血清對前肢芽軟骨的發(fā)育具有一定抑制作用,存在潛在的胚胎發(fā)育毒性。
　　 2.各劑量組菟絲子含藥血清均促進肢芽細胞增殖,以低劑量組最為顯著。中劑量菟絲子含藥血清可促進肢芽細胞的分化,高劑量卻抑制了肢芽細胞的分化。
　　 3.低和中劑量菟絲子含藥血清可使BMP-2 mRNA的表達水平升高