DEHP胚胎期暴露對(duì)大鼠子代神經(jīng)行為發(fā)育的影響及機(jī)制研究.pdf

1、前言：鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,簡(jiǎn)稱DEHP),屬于鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalic acid esters,PAE)中的重要成員,是塑料工業(yè)最主要的增塑劑之一。隨著DEHP產(chǎn)量的逐年增加,其在環(huán)境中的濃度也逐漸升高,對(duì)人體的毒性作用也越來越受到關(guān)注,國內(nèi)外許多國家已經(jīng)開始重視對(duì)DEHP的毒性研究、危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)及安全性監(jiān)控。
　　 目前對(duì)DEHP的神經(jīng)毒性及其機(jī)制的系統(tǒng)報(bào)道較少

2、而且尚無明確的結(jié)論。有研究證明DEHP孕期染毒使新生大鼠下丘腦視前交叉區(qū)芳香化酶(aromatase)表達(dá)減低,并對(duì)其活性產(chǎn)生影響。芳香化酶是神經(jīng)類固醇脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)及硫酸酯(Dhea sulfuric acid ester,DHEAS)和睪酮合成代謝的重要輔酶。DHEA及DHEAS和睪酮均對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有著重要保護(hù)作用。因此,DEHP導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制可能是通過影響芳香化酶開始的。

3、
　　 人類可廣泛暴露于鄰苯二甲酸酯類物質(zhì),其中婦女因使用含鄰苯二甲酸的化妝品和個(gè)人護(hù)理用品成為鄰苯二甲酸酯的高危人群,DEHP可以通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi),在胎兒體內(nèi)聚集,也可直接作用于胎兒。但如果在孕期接觸DEHP,由于胎兒的血腦屏障尚未發(fā)育完成,DEHP可能通過胎盤進(jìn)入胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而影響到子代的腦發(fā)育。因此,本研究擬通過大鼠孕期暴露DEHP建立子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的動(dòng)物模型,通過觀察DEHP所致子鼠行為畸胎學(xué)、神

4、經(jīng)行為學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化,評(píng)價(jià)DEHP與子代神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)聯(lián)。另外,通過DEHP對(duì)神經(jīng)類固醇代謝酶類固醇急性調(diào)控蛋白(Steroids acute controlprotein,STAR)和細(xì)胞色素P450基因(cytochorme P450 gene,CYP19a1)mRNA水平及海馬神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B celllymphoma/leukemia-2 genes,bcl-2),bcl-2相關(guān)蛋白(

5、bcl-2 associated X protein,bax)mRNA水平的影響,探討DEHP可能的發(fā)育神經(jīng)毒性機(jī)制,進(jìn)而為DEHP安全性評(píng)價(jià)、危險(xiǎn)度評(píng)估及DEHP環(huán)境污染的監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及染毒清潔級(jí)Wistar大鼠雌性28只,體重220-250g,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為4組:對(duì)照組和低、中、高劑量組,每組7只。動(dòng)物交配∶雌雄大鼠以1

6、∶1同籠,次日晨于盤底及陰道檢查陰栓,查出陰栓者,記為妊娠1天,母鼠編號(hào)稱重,另籠飼養(yǎng),同時(shí)進(jìn)行如下處理。對(duì)照組:用玉米油灌胃;低劑量組(10 mg/kg/d DEHP):用含0.1％DEHP的玉米油溶液灌胃;中劑量組(100 mg/kg/d DEHP);用含1.O％DEHP的玉米油灌胃；高劑量組(500mg/kg/d DEHP):用含5％DEHP的玉米油溶液灌胃。實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物自由飲水,連續(xù)染毒19天至子鼠出生。每7天稱重1次。動(dòng)物室溫

7、度18-23℃,相對(duì)濕度45-55％,染毒結(jié)束后進(jìn)行各種指標(biāo)測(cè)定。
　　 二、觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法
　　 1、行為畸胎學(xué)指標(biāo)的測(cè)定
　　 2、神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)的測(cè)定
　　 (1)水迷宮試驗(yàn)
　　 (2)電穿梭試驗(yàn)
　　 3、海馬組織病理切片細(xì)胞形態(tài)的觀察:HE染色
　　 4、海馬組織細(xì)胞凋亡指標(biāo)的測(cè)定
　　 (1)海馬組織細(xì)胞凋亡率的測(cè)定
　　 (2)凋亡相關(guān)基因bcl

8、-2和bax mRNA水平的測(cè)定5、STAR和CYPl9al mRNA水平的測(cè)定
　　 三、數(shù)據(jù)處理采用EXCEL數(shù)據(jù)庫錄用數(shù)據(jù),SPSS16.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)描述主要以x±s形式表示。根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性,進(jìn)行單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn),LSD進(jìn)行多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 一、行為畸胎學(xué)指標(biāo)的測(cè)定負(fù)趨地性反射實(shí)驗(yàn)500 mg/ke/d

9、 DEHP組與對(duì)照組相比,達(dá)標(biāo)時(shí)間延遲,經(jīng)方差分析,其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.341;P=0.001)。空中翻正實(shí)驗(yàn)100mg/kg/dDEHP組、500mg/kg/d DEHP組與對(duì)照組相比,達(dá)標(biāo)時(shí)間延遲,經(jīng)方差分析,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100mg/kg/d DEHP組F=4.713,P=0.049;500 mg/kg/d DEHP組F=5.006,P=0.043)。
　　 二、神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)的測(cè)定
　　 (一)

10、DEHP不同劑量染毒對(duì)子鼠水迷宮試驗(yàn)參數(shù)的影響水迷宮測(cè)試時(shí),DEHP各劑量組與對(duì)照組相比,無論錯(cuò)誤次數(shù)還是潛伏期差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,10mg/kg/d、100mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP組與對(duì)照組相比,潛伏期延長(zhǎng)(F=11.221；P=0.000)；100mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP組與對(duì)照組相比,錯(cuò)誤次數(shù)增加(F=8.058；P=0.000)。
　　 (二)DEHP不同劑量染毒對(duì)子鼠電穿梭試

11、驗(yàn)參數(shù)的影響穿梭測(cè)試時(shí),DEHP各劑量組與對(duì)照組相比,電擊次數(shù)、主動(dòng)逃避時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,100mg/kg/d和500mg/kedd DEHP組與對(duì)照組相比,電擊次數(shù)增加,(F=6.984；P=0.000);10mg/kg/d、100mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP組與對(duì)照組相比,主動(dòng)逃避時(shí)間延長(zhǎng)(F=9.841；P=0.000)。
　　 三、海馬組織病理切片細(xì)胞形態(tài)的觀察將出生后7天的大鼠取海馬組織,制成標(biāo)本,

12、光鏡觀察發(fā)現(xiàn),10mg/kg/d、100mg/kg/d、500mg/kg/d劑量組海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組基本表現(xiàn)一致;500mg/kg/d高劑量組排列略顯混亂,未見明顯的病理學(xué)改變。
　　 四、海馬組織細(xì)胞凋亡率的測(cè)定出生后7天子代大鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率要明顯高于出生后21天,且出生后7天時(shí),隨著DEHP染毒劑量的增加,子代大鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡率有一定的上升趨勢(shì)。
　　 五、凋亡相關(guān)基因bcl-2和ba

13、x的測(cè)定不同劑量的DEHP染毒對(duì)海馬體bcl-2和bax的基因表達(dá)產(chǎn)生影響。隨著DEHP染毒劑量由低到高,bcl-2和bax基因擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中顯示的條帶由暗到亮,出現(xiàn)一定的劑量關(guān)系,尤其高劑量組與對(duì)照組目的基因表達(dá)條帶的明暗對(duì)比更為顯著,相對(duì)而言,半定量分析后bax的mRNA水平高于bcl-2。
　　 六、STAR和CYP19a1基因表達(dá)的測(cè)定DEHP不同劑量染毒對(duì)海馬組織STAR基因表達(dá)的影響并不明顯。DEHP不同劑量染毒對(duì)

14、海馬組織CYP19a1基因表達(dá)產(chǎn)生影響。隨著DEHP染毒劑量由低到高,CYP19a1基因擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中顯示的條帶由亮到暗,出現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,尤其是500mg/kg/d劑量組與對(duì)照組相比,CYP19al基因mRNA水平降低明顯。
　　 結(jié)論：本研究采用整體試驗(yàn)動(dòng)物的方法,通過DEHP胚胎期暴露對(duì)大鼠子代神經(jīng)行為發(fā)育的影響及其相關(guān)指標(biāo)檢測(cè),得出如下研究結(jié)論:
　　 1、DEHP胚胎期暴露對(duì)子鼠的神經(jīng)行為的發(fā)育有負(fù)面影

15、響。
　　 2、DEHP胚胎期暴露可使出生后7天子鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率增加。
　　 3、DEHP胚胎期暴露可使出生后7天子鼠海馬組織凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的表達(dá)改變,使bcl-2/bax的比值減小,提示細(xì)胞凋亡的增加。
　　 4、隨著DEHP胚胎期暴露劑量的增加,海馬神經(jīng)元CYPl9a1tuRNA水平降低,STAR基因的表達(dá)無明顯變化。提示DEHP降低芳香化酶表達(dá)從而干擾神經(jīng)類固醇合成代謝。