母體孕期DEHP暴露對(duì)子代小鼠性別發(fā)育的干擾機(jī)制.pdf

1、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯(DEHP)作為增塑劑，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品包裝材料、醫(yī)用材料等領(lǐng)域。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，DEHP暴露引起了哺乳動(dòng)物多種生殖發(fā)育損傷，其中精液質(zhì)量下降最為顯著。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，DEHP能夠通過抗雄激素方式，干擾雄性大鼠的生殖發(fā)育，但人類和小鼠雄性中存在DEHP誘導(dǎo)的性激素干擾的抗性。DEHP孕期暴露造成的人類和小鼠后代生殖發(fā)育損傷具有非性激素依賴性，但機(jī)制不明確。此外，DEHP孕期暴露誘導(dǎo)的雌性后代生

2、殖發(fā)育毒性及其機(jī)制尚不明確。
　　本論文的研究目的是基于性別決定調(diào)控過程紊亂，闡明孕期DEHP暴露對(duì)雄性和雌性仔鼠的生殖發(fā)育損傷的分子機(jī)制。將ICR小鼠孕鼠灌胃染毒DEHP，染毒劑量包括人類暴露相關(guān)劑量。研究DEHP對(duì)胚胎期性別決定調(diào)控通路關(guān)鍵基因表達(dá)時(shí)序和表達(dá)量的影響。并進(jìn)一步研究胚胎期DEHP暴露對(duì)仔鼠出生后支持細(xì)胞和顆粒細(xì)胞分化、性激素合成和性腺組織學(xué)影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)孕期DEHP暴露對(duì)于雄性性

3、別決定調(diào)控通路關(guān)鍵基因的影響。采用實(shí)時(shí)定量PCR和整胚原位雜交(WISH)方法檢測(cè)了胚胎期10.5-13.5 d性別決定調(diào)控通路關(guān)鍵基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示:2-700 mg/kg/d DEHP孕期暴露擾亂了Y染色體上性別決定因子基因(Sry)精確時(shí)序性表達(dá)，并延遲了其表達(dá)量到達(dá)閾值的時(shí)間。700 mg/kg/d DEHP暴露使得Sry在性別決定關(guān)鍵窗口期的表達(dá)下降了2.5倍。支持細(xì)胞分化決定因子睪丸特異性轉(zhuǎn)錄因子Sry相關(guān)基因9(S

4、ox9)在整個(gè)性別決定期的表達(dá)均受到顯著抑制，并且11.5dpc時(shí)，700 mg/kg/d DEHP暴露導(dǎo)致Sox9表達(dá)量下降了5倍。雄性性別決定調(diào)控通路中Sry上游基因生長(zhǎng)阻滯及DNA損傷誘導(dǎo)45γ基因(Gadd45g)和鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因4(Gata4)的表達(dá)顯著抑制。WISH與RT-qPCR結(jié)果一致，證明性別決定關(guān)鍵窗口期Sry時(shí)序性表達(dá)的紊亂。結(jié)果提示2-700 mg/kg/d DEHP顯著抑制胚胎雄性決定通路在11.5dpc的開

5、啟，涉及的通路為:Gadd45g→Gata4/Fog2→Sry→Sox9→Fgf9。
　　(2)孕期DEHP暴露對(duì)雄性仔鼠出生后支持細(xì)胞分化和睪丸組織學(xué)影響。利用RT-qPCR檢測(cè)了出生后第1天(PND1)和第21天(PND21)雄性仔鼠中支持細(xì)胞分化維持和增殖標(biāo)志基因Sox9和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(Fgf9)的表達(dá)變化，以及類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白基因(Star)和膽固醇側(cè)鏈裂解酶基因(Cyp11a1)的表達(dá)變化;利用蛋白質(zhì)印

6、記(Western blot)法檢測(cè)了仔鼠睪丸中支持細(xì)胞標(biāo)志因子SOX9和FGF9,同時(shí)檢測(cè)了參與支持細(xì)胞對(duì)生殖細(xì)胞分化發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵蛋白Double-sex和Mab-3轉(zhuǎn)錄因子1(DMRT1)的水平;通過組織病理學(xué)分析檢測(cè)了PND21仔鼠睪丸組織學(xué)變化。結(jié)果顯示:2-200 mg/kg/d DEHP孕期暴露顯著抑制PND1和21仔鼠睪丸Sox9和Fgf9表達(dá)，同時(shí)SOX9、FGF9和DMRT1的表達(dá)水平顯著下降。200 mg/kg/d

7、 DEHP孕期暴露組中，這三種蛋白的表達(dá)水平分別下降了1.5、3和2倍。表明雄性睪丸支持細(xì)胞分化和增殖受損，將會(huì)導(dǎo)致精子生成障礙。Star和Cyp11a1的表達(dá)未受到顯著影響，證明仔鼠雄性激素生成未受顯著影響。PND21仔鼠睪丸出現(xiàn)了生精小管內(nèi)支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞缺失。結(jié)果表明，孕期DEHP暴露造成雄性小鼠出生后支持細(xì)胞分化和功能損傷，進(jìn)而導(dǎo)致精子生成受阻，對(duì)性別決定調(diào)控通路的干擾是其非性激素依賴機(jī)制之一。
　　(3)孕期DEHP暴

8、露對(duì)于雌性性別決定調(diào)控通路關(guān)鍵基因的影響。利用RT-qPCR和WISH方法檢測(cè)了雌性胚胎期11.5-13.5 d時(shí)，雌性性別決定調(diào)控通路關(guān)鍵基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示:2-200 mg/kg/d DEHP顯著上調(diào)了雌性胚胎性別決定調(diào)控關(guān)鍵基因叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子基因2(Foxl2)、無翼乳房腫瘤病毒相關(guān)整合位點(diǎn)4(Wnt4)、β鏈蛋白(β-catenin)和卵泡抑制素(Fst)的表達(dá)，并且11.5 dpc時(shí)，200 mg/kg/d DEHP暴

9、露導(dǎo)致這些基因的表達(dá)量分別升高了1.7、1.5、1.6和1.8倍。提示胚胎期雌性顆粒細(xì)胞分化和發(fā)育過程受到干擾。WISH與RT-qPCR結(jié)果一致，證明Wnt4表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明DEHP孕期暴露能夠通過異常激活雌性胚胎性別發(fā)育通路干擾雌性性別發(fā)育。
　　(4)孕期DEHP暴露對(duì)雌性仔鼠出生后卵巢分化和組織學(xué)影響。利用RT-qPCR檢測(cè)了PND1和21雌性仔鼠中顆粒細(xì)胞分化和卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)基因Foxl2和Fst的表達(dá)，以及Star和Cy

10、p11a1的表達(dá)變化;利用Western blot檢測(cè)了PND21仔鼠卵泡發(fā)育調(diào)控蛋白FST的水平;通過組織病理學(xué)分析檢測(cè)了PND21仔鼠卵巢組織學(xué)變化。結(jié)果表明:2-200 mg/kg/d DEHP孕期暴露顯著升高了PND1和21雌性仔鼠卵巢中Foxl2表達(dá)，同時(shí)Fst表達(dá)被顯著抑制，而200 mg/kg/d DEHP暴露導(dǎo)致PND21仔鼠卵巢FST表達(dá)水平下降了3倍。表明顆粒細(xì)胞分化維持的損傷和卵泡發(fā)育進(jìn)程紊亂。與雄性不同，Star

11、和Cyp11a1的表達(dá)受到顯著抑制，提示出生后仔鼠雌性激素生成受到影響。雌性PND21仔鼠卵巢髓質(zhì)部卵泡閉鎖明顯增加，表明卵巢發(fā)育進(jìn)程提前。結(jié)果表明，DEHP可通過異常激活雌性性別決定通路，誘導(dǎo)雌性仔鼠顆粒細(xì)胞分化和功能異常，進(jìn)而干擾卵泡發(fā)育進(jìn)程，導(dǎo)致卵泡閉鎖的提前和卵巢的過早發(fā)育。
　　綜上，2-700 mg/kg/d DEHP孕期暴露顯著干擾了雄性性別決定基因Sry精確表達(dá)的時(shí)序性表達(dá)，性別決定調(diào)控通路Gadd45g→Gata

12、4/Fog2→Sry→Sox9→Fgf9受干擾，導(dǎo)致雄性仔鼠出生后支持細(xì)胞分化發(fā)育異常和精子生成障礙。提示干擾胚胎期性別決定調(diào)控過程是DEHP雄性生殖發(fā)育毒性的重要非性激素依賴性機(jī)制。同時(shí)，2-200 mg/kg/dDEHP誘導(dǎo)雌性胚胎期性別決定調(diào)控通路上關(guān)鍵因子Foxl2、Fst、Wnt4和β-catenin表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致雌性發(fā)育通路異常激活，誘導(dǎo)仔鼠顆粒細(xì)胞分化和功能異常以及卵泡發(fā)育提前。本論文揭示了DEHP新的雄性和雌性生殖發(fā)育毒