圍產(chǎn)期低劑量氯化三丁基錫暴露對(duì)子代雄性小鼠的內(nèi)分泌干擾作用及其機(jī)制初探.pdf

1、研究背景：
　　 有機(jī)錫化合物(Organotin compounds，OTs)廣泛用于船舶表面防生物附著涂料、殺蟲劑、防腐劑（木材、纖維及皮革）、工業(yè)殺菌劑、塑料制品穩(wěn)定劑等。由于應(yīng)用廣泛、環(huán)境中殘存時(shí)間長(zhǎng)，OTs已對(duì)全球環(huán)境（尤其是水體）造成了嚴(yán)重的污染。三丁基錫(Tributyltin，TBT)是OTs中最重要的一種，被認(rèn)為是迄今為止由人為因素大量引入海水環(huán)境中最毒的化學(xué)品之一。它是一種確定的內(nèi)分泌干擾物(ED)，已有研究

2、顯示TBT對(duì)哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性等。但這些研究所采用的染毒劑量都較大，而許多研究表明ED的危害并不呈線性劑量-反應(yīng)關(guān)系，低劑量時(shí)的危害有可能要高于其高劑量時(shí)的危害。我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期低劑量氯化三丁基錫(TBTCl)暴露可導(dǎo)致子鼠睪丸中雌激素水平紊亂，附睪中精子數(shù)量減少及精子活度降低，睪丸組織出現(xiàn)病理性變化，并伴隨著芳香酶含量的下降。目前對(duì)TBTCl導(dǎo)致子代雄性小鼠發(fā)生以上變化的機(jī)制并不清楚，本研究在前期

3、研究的基礎(chǔ)上以子代雄性小鼠為主要研究對(duì)象，并添加己烯雌酚(DES)組作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)TBTCl影響妊娠結(jié)果、子鼠性發(fā)育及身體發(fā)育和血清中激素水平及其機(jī)制在分子和基因水平上做初步的探索。為研究TBTCl對(duì)人類的內(nèi)分泌干擾作用及作用機(jī)制提供參考和借鑒。
　　 研究目的:
　　 探討圍產(chǎn)期低劑量TBTCl暴露對(duì)妊娠結(jié)果、子鼠發(fā)育和血清中激素水平的毒性作用，并且對(duì)其作用機(jī)制做初步的探索。
　　 研究方法:
　　

4、將受孕的KM小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（玉米油）、10、100μg/kg TBTCl組和陽(yáng)性對(duì)照組(5μg/kg DES)，每組6只。母鼠妊娠第6天(GD6)起，經(jīng)口灌胃染毒，每天在同一時(shí)間染毒1次，染毒劑量為1 ml/kg，直到哺乳期結(jié)束，即子鼠出生第21天(Postnatal day，PND21)。GD0、GD6、PND1和PND21時(shí)稱量母鼠體重，染毒后開(kāi)始觀察并記錄母鼠的流產(chǎn)及死亡情況;母鼠生產(chǎn)后，觀察并記錄出生子鼠的數(shù)量及雌雄比例

5、，觀察死亡情況并記錄每組子鼠在哺乳期死亡的數(shù)量。PND0、1、2、3、4、6、7、14和21時(shí)稱量雄性子鼠體重，測(cè)量其肛門與生殖器之間的距離(AGD)。PND6時(shí)開(kāi)始觀察長(zhǎng)毛情況，PND7時(shí)開(kāi)始觀察門牙萌生情況，PND12時(shí)開(kāi)始觀察睜眼情況，PND13時(shí)開(kāi)始觀察睪丸下降情況及PND28時(shí)開(kāi)始觀察包皮分離情況并分別記錄其日齡。
　　 PND22和100時(shí)每組隨機(jī)抽取10只雄性子鼠（陽(yáng)性對(duì)照取8只），稱重后摘眼球取血，離心取血清并保

6、存;分離睪丸、附睪、腦、肝臟、脾臟、腎臟和胸腺（PND100時(shí)還取腹側(cè)前列腺、精囊），并稱重;將睪丸立即放入液氮中速凍并置于-80℃保存。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法測(cè)定PND22和PND100雄性子鼠血清中雌激素(E2)、睪酮(T)、游離睪酮(F-T)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)的濃度。采用Real-time PCR法檢測(cè)PND22子代小鼠睪丸組織中Cyp11a1、Cyp17a、Hsd3b2、Hsd17b3和Cyp19五個(gè)基

7、因mRNA相對(duì)表達(dá)量，并用亞硫酸鹽直接測(cè)序法(BSP)檢測(cè)調(diào)控芳香酶表達(dá)的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、泛素/蛋白酶體亞基α2和雌激素受體β基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化情況。
　　 研究結(jié)果
　　 劑量組孕鼠的流產(chǎn)（死亡）率與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著降低，與陰性對(duì)照組相比有增加的趨勢(shì);100μg/kg TBTCl組母鼠在PND21時(shí)體重較對(duì)照組均顯著增加，PND1-21和GD0-PND21母鼠體重增加量與對(duì)照組相比均顯著增加，G

8、D6-PND21母鼠體重增加量較陰性對(duì)照組顯著升高;劑量組子鼠的數(shù)量較對(duì)照組有下降的趨勢(shì);100μg/kg TBTCl組和陽(yáng)性對(duì)照組幼鼠死亡數(shù)與陰性對(duì)照組相比均顯著增加，而陽(yáng)性對(duì)照組和100 ug/kg TBTCl組幼鼠死亡數(shù)相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 劑量組睪丸下降時(shí)間與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著提前，而與陰性對(duì)照組相比沒(méi)有差異，陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比顯著延遲。PND0、1時(shí)100μg/kg TBTCl組的NAGD較陰性對(duì)照組顯著

9、降低，體重顯著升高;PND3、6、14和21時(shí)TBTCl組NAGD與對(duì)照組相比有降低的趨勢(shì)。PND0、1、2、6、7和21時(shí)100μg/kg組體重與陰性對(duì)照組相比顯著增加，PND4-6、PND0-7、PND14-21、PND0-21的體重增加量與陰性對(duì)照組相比均顯著增加。PND22時(shí)100μg/kg組睪丸臟器系數(shù)較對(duì)照組均顯著降低;劑量組肝臟臟器系數(shù)與對(duì)照組相比均顯著降低，脾臟重量及臟器系數(shù)與對(duì)照組相比顯著增加，腎臟重量及臟器系數(shù)與陰性

10、對(duì)照組相比顯著增加。PND100時(shí)TBTCl組睪丸重量與陰性對(duì)照組相比顯著升高，而與陽(yáng)性對(duì)照組相比則顯著降低;100μg/kg組精囊臟器系數(shù)與陰性對(duì)照組相比顯著降低，肝臟臟器系數(shù)與陰性對(duì)照組相比顯著升高;胸腺臟器系數(shù)與陰性對(duì)照組相比顯著降低，與陽(yáng)性對(duì)照組相比則顯著升高。
　　 子代雄性小鼠血清中激素測(cè)量結(jié)果顯示，PND22時(shí)100μg/kg組的E2和FSH濃度與對(duì)照組相比均顯著降低;PND100時(shí)100μg/kg組血清中E2的水

11、平與陰性對(duì)照組相比仍顯著降低，而與陽(yáng)性對(duì)照組相比則沒(méi)有差異，陽(yáng)性對(duì)照組血清中E2的水平與陰性對(duì)照組相比也顯著降低。
　　 PND22子代雄性小鼠睪丸組織中類固醇激素合成途徑關(guān)鍵酶mRNA相對(duì)定量結(jié)果顯示，10μg/kg組Cyp17α基因mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著升高，Hsd3b2基因mRNA表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比顯著升高，而與陽(yáng)性對(duì)照組相比則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;100μg/kg組Hsd17b3基因和Cyp19基因mRNA表達(dá)量

12、與陰性對(duì)照組相比顯著降低，劑量組Cyp19基因mRNA表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，而與陽(yáng)性對(duì)照組相比則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;陽(yáng)性對(duì)照組Hsd17b3基因和yp19基因的mRNA表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比有降低的趨勢(shì)，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Cyp11a1基因在各染毒組中mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 PND22子代雄性小鼠睪丸組織中甲基化克隆測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)啟動(dòng)子區(qū)域基因序列發(fā)生甲基化改變，而泛素