孕期炎癥刺激對子代小鼠體重的影響及機(jī)制研究.pdf

1、肥胖是很多慢性疾?。ǜ哐獕骸⑻悄虿〉龋┑恼T因和基礎(chǔ)，對全球人類健康產(chǎn)生巨大的威脅。目前，對肥胖成因的研究大多歸結(jié)于遺傳因素、不良的飲食習(xí)慣以及缺乏身體活動(dòng)，治療也主要是針對肥胖或/和有肥胖先兆的人體/動(dòng)物進(jìn)行。但在人們普遍注意健康生活方式的今天，其發(fā)病率仍逐年迅猛增加，提示有其他新的重要致病機(jī)制存在。在對低出生體重兒和宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎兒的研究中發(fā)現(xiàn)成年后出現(xiàn)肥胖及代謝綜合征的幾率是正常兒童的5.75倍，提示胎兒的宮內(nèi)發(fā)育是影響成年后肥胖的

2、獨(dú)立因素。因此，著眼于生命早期，研究探討肥胖/超重發(fā)病的新病因，對肥胖及其相關(guān)代謝疾病的防治具有重大意義。本室前期研究發(fā)現(xiàn)，母體孕期炎癥刺激能導(dǎo)致子代發(fā)生高血壓并伴有體重明顯增加[1,2]。同時(shí)，肥胖及其相關(guān)代謝綜合征又與高血壓的發(fā)生、發(fā)展高度相關(guān)[3]。
　　miRNAs是長度約為23個(gè)核苷酸且具有mRNA調(diào)控功能的單鏈非編碼RNA，它在轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控中起著重要作用。多個(gè)高通量研究表明一些miRNAs在代謝性疾病中差異表達(dá)

3、，相關(guān)miRNAs在糖尿病和高脂模型中的調(diào)控作用已被報(bào)道[4，5]，對miRNAs在疾病中調(diào)控作用的研究受到廣泛關(guān)注。
　　本室前期成功創(chuàng)建的孕期炎癥刺激致子代動(dòng)物高血壓和肥胖模型，為本課題的開展奠定了良好的基礎(chǔ)。但是，孕期炎癥刺激子代小鼠肥胖的類型、對子代脂肪發(fā)育的影響、miRNAs的變化，以及miRNAs變化與子代脂肪發(fā)育改變的關(guān)系等科學(xué)問題均有待闡明。為此，本文即對上述幾個(gè)問題進(jìn)行了初步研究，以期為深化對肥胖及相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)

4、制的認(rèn)識(shí)提供新思路，并為尋找新的防治分子靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.孕期炎癥刺激對子代小鼠體重及部分代謝指標(biāo)的影響的研究方法
　　1.1、8w齡C57小鼠，雌∶雄=2∶1的比例同籠過夜，第二天7:00前觀察陰栓，確定孕鼠。
　　1.2、孕11d給予孕鼠一次性腹腔注射脂多糖(LPS)(75μg/kg)，對照組注射0.2ml的生理鹽水。分別于子鼠4w、8w、12w取材。
　　1.3、兩組子鼠從出生開

5、始進(jìn)行體重監(jiān)測，每2w測量一次體重(g)和體長(cm)，直到12w。并計(jì)算對應(yīng)Lee's指數(shù)(Lee's指數(shù)=[體重(g)×103/體長(cm)]1/3)。
　　1.4、子鼠4w、8w和12w時(shí)，斷頸處死。取雌鼠腎周脂肪、雄鼠附睪脂肪，稱重并計(jì)算脂肪系數(shù)（脂肪系數(shù)=脂肪濕重/體重×100）。
　　1.5、對4w、8w、12w的子鼠，麻醉后進(jìn)行Micro-CT檢測，利用Mimics10.01分析皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪分布情況。

6、r>　　1.6、子鼠4w、8w和12w取血清，檢測血總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)含量。
　　1.7、對4w、8w及12w的子鼠禁食12h后檢測空腹血糖。然后，灌服2.5g/kg的20％的葡萄糖溶液，分別于灌服后0.5h、1h、2h及3h檢測血糖。
　　2.孕期炎癥刺激致子代小鼠肥胖的機(jī)制研究的研究方法
　　2.1、取4w、8w、12w子鼠內(nèi)臟脂肪組織。采用常規(guī)石蠟包

7、埋后進(jìn)行HE染色。在40×顯微鏡下，隨機(jī)選取8-10個(gè)視野進(jìn)行觀察檢測，并統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞直徑大小(μm)。
　　2.2、Real-time PCR法檢測4w、8w、12w子鼠脂肪組織中脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物的基因表達(dá)水平。(CEBP/α、CEBP/β、CEBP/δ、aP2、PPARγ)
　　2.3、Real-time PCR法檢測4w、8w、12w子鼠脂肪中miR-143、miR-320、miR-375、miR-126、 miR-

8、218、miR-16、miR-224、miR-423、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-145、 miR-214、miR-351、miR-30c、miR-30d、miR-30e、miR-199a、miR-23b、miR-290的表達(dá)水平。
　　2.4、Real-time PCR法檢測miR-224、miR-200b、miR-30d在子鼠附睪脂肪組織的脂肪間質(zhì)血管成分(SVF)及成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平。

9、
　　2.5、Real-time PCR法檢測miR-224、miR-200b、miR-30d在子鼠附睪脂肪SVF部分各個(gè)亞型中的表達(dá)水平。
　　2.6、用MTT法、EdU法分別檢測miR-200b、miR-224、miR-30d對3T3-L1細(xì)胞增殖的影響。
　　2.7、油紅O染色觀測3T3-L1分化情況，Real-time PCR法檢測每組中脂肪分化標(biāo)志物的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.母體孕期炎癥刺

10、激對子代小鼠體重及部分代謝指標(biāo)的影響
　　1.1、與NS組相比，LPS組4w雌鼠體重顯著升高(p＜0.05)，雄鼠體重增加非常顯著(p＜0.01);6w～12w，雌鼠及雄鼠體重均顯著升高(p＜0.01)。與NS組相比，4w LPS組雌鼠Lee's指數(shù)顯著增高(p＜0.05);雄鼠升高非常顯著(p＜0.01);6w～12w，雌雄鼠Lee's指數(shù)均顯著升高(p＜0.01)。
　　1.2、4w時(shí)，LPS組子代雄鼠附睪脂肪濕重顯著高

11、于NS組(p＜0.05)，附睪脂肪系數(shù)有升高趨勢但無顯著性差異。8w和12w LPS組子代小鼠肪濕重和脂肪系數(shù)均顯著高于NS組(p＜0.05)。
　　1.3、micro-CT結(jié)果顯示，4w、8w和12w子代雌/雄性小鼠，LPS組內(nèi)臟脂肪顯著高于NS組(p＜0.01)。而皮下脂肪的變化并無顯著性差異(p＞0.05)。
　　1.4、與NS組相比，4w/8w/12w LPS組子代小鼠空腹血糖無顯著性差異，但在口服糖耐量實(shí)驗(yàn)中，LP

12、S組子鼠的血糖應(yīng)答曲線下面積(AUC)顯著高于NS組(p＜0.01)，表現(xiàn)出糖耐量不良。
　　1.5、與NS相比，LPS組4w雌鼠血清TC、LDL顯著升高(p＜0.05)，雄鼠血清TC、TG、LDL和HDL顯著升高(p＜0.05);8w雌鼠血清TC和HDL顯著升高(p＜0.05)，雄鼠血清TG、TC和HDL顯著升高(p＜0.05);12w雌鼠血清TC和HDL顯著降低(p＜0.05)，雄鼠血清TC、TG、HDL和LDL顯著性升高(p

13、＜0.05)。LPS組子代小鼠表現(xiàn)出血脂異常。
　　2.孕期炎癥刺激致子代小鼠肥胖的機(jī)制研究
　　2.1、與NS組相比，LPS組4w子代小鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)無明顯變化（雌鼠腎周脂肪細(xì)胞，雄鼠附睪脂肪細(xì)胞）;8w子代小鼠脂肪細(xì)胞直徑顯著增大(p＜0.05);12w子代小鼠脂肪細(xì)胞直徑增大非常顯著(p＜0.01)。
　　2.2、與NS組相比，LPS組4w子鼠脂肪分化標(biāo)志物aP2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β和CEBP

14、/δ的表達(dá)均無顯著性差異(p＞0.05);8w子鼠脂肪組織中CEBP/δ表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.05)，aP2、PPARγ和CEBP/α表達(dá)上調(diào)非常顯著(p＜0.01)，CEBP/β表達(dá)無明顯變化;12w子鼠脂肪中aP2、PPARγ、CEBP/α和CEBP/δ表達(dá)顯著性上調(diào)(p＜0.01)，CEBP/β表達(dá)無明顯變化。
　　2.3、與NS組相比，LPS組4w子鼠脂肪組織中1個(gè)miRNAs(miR-199a)顯著性上調(diào)(p＜0.05)

15、，8個(gè)miRNAs顯著性下調(diào)(p＜0.05);8w子鼠脂肪組織中包括miR-199a等17個(gè)miRNAs顯著性下調(diào)(p＜0.01);12w子鼠脂肪組織中17個(gè)miRNAs顯著性下調(diào)(p＜0.01)，其中15個(gè)與8w變化一致，另有miR-30d、miR-30e顯著性下調(diào)表達(dá)。
　　2.4、根據(jù)miRNAs的差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及生物信息學(xué)分析，選擇miR-200b、miR-224和miR-30d為研究對象。與NS組相比，mi

16、R-200b、miR-224和miR-30d在LPS組子鼠脂肪的成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)無明顯變化;但在LPS組子鼠脂肪基質(zhì)血管成分(SVF)部分的表達(dá)顯著降低(p＜0.05)。
　　2.5、利用流式細(xì)胞術(shù)分選出SVF部分各細(xì)胞亞型:內(nèi)皮細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞/脂肪間質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。與NS組相比，miR-224在LPS組前脂肪細(xì)胞/脂肪間質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)顯著降低(p＜0.05)，而在其他細(xì)胞亞型的表達(dá)無顯著差異;miR-224、

17、miR-30d在各細(xì)胞亞型的表達(dá)均無顯著性差異。另外，LPS組SVF中巨噬細(xì)胞比例明顯升高。
　　2.6、選擇前脂肪細(xì)胞3T3-L1為研究對象。發(fā)現(xiàn)僅miR-200b有顯著性抑制前脂肪細(xì)胞增殖的作用(p＜0.05)，而anti-miR200b有促進(jìn)增殖的趨勢。
　　2.7、與陰性對照相比，僅anti-miR224有顯著性促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的作用;而miR-224有抑制前脂肪細(xì)胞分化的趨勢。其他組別未見明顯作用。

18、
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代小鼠體重增加是以內(nèi)臟脂肪增加為特征的中心性肥胖，并出現(xiàn)血脂異常和糖耐量下降。
　　2.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代小鼠出現(xiàn)脂肪發(fā)育異常變化。
　　3.miR-200b有抑制前脂肪細(xì)胞增殖的作用，anti-miR224有促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化的作用。miR-224在子代小鼠脂肪原代前脂肪細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。
　　4.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代小鼠肥胖的機(jī)制可能與脂肪發(fā)育異常及miRNAs表