孕期炎癥免疫刺激對子代大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響及其與高血壓的關(guān)系.pdf

1、腎臟是調(diào)節(jié)水鹽代謝的重要器官,具有多種內(nèi)分泌功能。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)作為一個調(diào)節(jié)血壓、維持水電解質(zhì)平衡的整體,它的過度激活在高血壓及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。經(jīng)典的RAS是指循環(huán)的RAS,而目前的研究表明,除了經(jīng)典的RAS外,在腎臟還存在著局部組織的RAS。腎內(nèi)的RAS不但可以調(diào)節(jié)腎臟血管活性,保持水鹽代謝平衡,還可以調(diào)控組織生長。RAS系統(tǒng)的正?；钚詫δI臟的發(fā)育至關(guān)重要,孕期母體應用血管緊張素受體抑制劑或血管

2、緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑會導致胚胎發(fā)育異常,引起成年后腎功能下降。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要效應因子,除了收縮血管和調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡外,還參與了炎癥反應的重要過程,在高血壓的形成和靶器官的損傷中起著重要的作用。因此,任何原因如果改變了腎內(nèi)RAS的活性,則引起腎臟的病理生理改變,導致腎臟損害和高血壓的發(fā)生。
　　 目前的研究表明,炎癥和高血壓有很大的相關(guān)性,高血壓患者血漿中促炎細胞因子如TNF-α、IL-6明顯

3、增高。LPS是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的脂多糖,常作為非特異性炎癥免疫刺激劑模擬細菌炎癥反應。LPS和它的特異性受體TLR4結(jié)合后啟動一系列的磷酸化反應,促使核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核,誘導TNF-α、IL-1β和IL-6的轉(zhuǎn)錄和釋放,最終導致炎癥反應。Pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)是合成的抗氧化劑,通過阻止IkB的降解和NF-kB向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移抑制NF-kB活性,被認為是強有力的NF-kB抑制劑

4、。酵母多糖是單細胞真菌酵母菌細胞壁的成分,主要由β-葡聚糖和甘露聚糖組成。酵母多糖是TLR2/6受體的特異性配體,它能激活單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞,刺激炎癥介質(zhì)的釋放,包括TNF-α、IL-8和過氧化氫,引起全身性的炎癥反應。我們研究室以往的研究顯示,孕期第8、10、12天母體應用脂多糖(LPS)或酵母多糖(Zymosan)刺激引起子代成年大鼠發(fā)生高血壓,但其機制目前尚不清楚。由于孕期第8、10、12天正值腎臟早期發(fā)育的關(guān)鍵時間窗,

5、我們設想,孕期炎癥刺激可能影響了子代大鼠腎臟的發(fā)育,導致腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常而引起了高血壓。本研究應用LPS或Zymosan兩種分別來自細菌和真菌的免疫刺激劑探討孕期炎癥免疫刺激對子代大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響及其初步機制,旨在為高血壓的預防和治療提供新思路。
　　 方法
　　 在孕期暴露于LPS的模型中,孕鼠(SD大鼠)被隨機分成四個組(每組8只):對照組、LPS組、PDTC組和LPS+PDTC組。其中LPS組動物于孕第8

6、、10、12天給予腹腔注射LPS0.79mg/kg,LPS+PDTC組動物在給予LPS的基礎上,在孕第8～14天每天給予腹腔注射PDTC100 mg/kg。對照組和PDTC組大鼠分別于相應時間給予生理鹽水或PDTC。
　　 在孕期暴露于Zymosan的模型中,孕鼠被隨機分為2組,每組6只。對照組:在孕第8、10、12天每天給予腹腔注射生理鹽水0.5ml。Zymosan組:在孕第8、10、12天每天給予腹腔注射Zymosan2.3

7、7mg/kg。
　　 1.為評價子鼠腎臟發(fā)育情況,在子鼠7周齡時采用酸浸漬法測定單腎腎小球數(shù)量。
　　 2.為了評估子鼠腎功能,在子鼠7、16和25周齡時測定肌酐清除率和尿蛋白水平。血肌酐和尿肌酐的測定采用多通道動態(tài)分光光度法,尿蛋白測定用連續(xù)注射分光光度法。
　　 3.Real-time PCR測1日齡和7、16、25周齡大鼠腎皮質(zhì)腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的mRNA表達。
　　 4.用免疫組織化學染色或T

8、UNEL染色測大鼠腎臟AngⅡ-陽性細胞、單核-巨噬細胞、淋巴細胞、Ⅰ型膠原和TUNEL核陽性細胞的表達。
　　 5.用放射性免疫測定方法測7、16、25周齡子鼠血漿腎素活性和AngⅡ水平。
　　 6.Western blot測1日齡和7、16、25周齡大鼠腎皮質(zhì)AT1-R的蛋白表達。
　　 7.凝膠電泳遷移率實驗測25周齡大鼠腎皮質(zhì)NF-kB的活性。
　　 8.基因芯片分析胚胎Angiotensinog

9、en、Renin、AT1-R和AT2-R的表達并對變化基因進行Real-time PCR驗證。
　　 9.子鼠動脈血壓從7周齡開始測,每3個月測量一次,一直測到25周齡。血壓的測定采用標準尾套法大鼠尾動脈血壓測定方法。
　　 結(jié)果
　　 1.孕期暴露于LPS引起子代大鼠腎小球數(shù)量明顯降低,PDTC能夠有效逆轉(zhuǎn)LPS引起的腎小球數(shù)量的降低。
　　 2.孕期暴露于LPs引起7、16、25周齡子代大鼠肌酐清除率

10、明顯降低而尿蛋白水平明顯增高。PDTC能夠完全逆轉(zhuǎn)LPS引起的肌酐清除率降低和尿蛋白的增高。
　　 3.孕期暴露于LPS降低子代新生大鼠腎皮質(zhì)腎素mRNA的表達而增加7、16、25周齡大鼠腎皮質(zhì)腎素mRNA的表達。PDTC能有效抑制孕期LPS引起的腎素mRNA表達的變化。
　　 4.孕期暴露于LPS增加25周齡子代大鼠ACE mRNA的表達。新生鼠和7、16周齡子鼠ACE mRNA的表達各組相比無統(tǒng)計學意義。
　　

11、 5.孕期暴露于LPS引起新生子鼠腎皮質(zhì)AngⅡ-陽性細胞明顯降低,而7、16、25周齡子鼠腎皮質(zhì)AngⅡ-陽性細胞明顯增加。PDTC能有效逆轉(zhuǎn)這些變化。
　　 6.孕期暴露于LPS對子代成年大鼠血漿腎素活性和血管緊張素Ⅱ水平無影響。
　　 7.腎皮質(zhì)AT1-R蛋白表達和腎素mRNA表達呈負相關(guān)。LPS處理組大鼠新生子鼠AT1-R蛋白表達增高,而7、16、25周齡子鼠AT1-R蛋白表達降低。PDTC能有效逆轉(zhuǎn)這些變化。

12、
　　 8.孕期暴露于LPS引起子代大鼠腎皮質(zhì)NF-kB活性增高。
　　 9.孕期暴露于Zymosan引起子代大鼠。腎小球數(shù)量減少、腎功能下降。
　　 10.孕期暴露于Zymosan引起7、16、25周齡子代大鼠腎皮質(zhì)腎素mRNA表達增高、腎臟AngⅡ-陽性細胞增多,對血漿腎素活性和血管緊張素Ⅱ水平無影響。
　　 11.孕期暴露于LPS顯著下調(diào)胚胎AT2-R受體的表達而上調(diào)胚胎炎癥因子IL-6和TNF-α

13、的表達,并增加子代成年大鼠腎臟單核巨噬細胞浸潤、TUNEL核陽性細胞及Ⅰ型膠原的表達。
　　 結(jié)論
　　 1.孕期炎癥免疫刺激引起子代大鼠腎臟發(fā)育異常和腎功能損害;
　　 2.胚胎AT2-R表達下調(diào)、新生子鼠AngⅡ表達降低、凋亡增加和炎癥是孕期炎癥免疫刺激引起子代大鼠腎臟發(fā)育異常和功能損害的重要原因;
　　 3.以腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性改變?yōu)闃酥镜哪I臟發(fā)育異常和功能損害是孕期炎癥免疫刺激導致子代大