孕期炎癥刺激對子代大鼠血管反應(yīng)性的影響及其初步機(jī)制研究.pdf

1、高血壓(Hypertension，HP)是一種引起高死亡率和高致殘率的成年慢性疾病，目前世界上平均1/4成年人患有高血壓，預(yù)計到2050年將達(dá)到29%。在全球廣泛采取一級預(yù)防和二級預(yù)防措施的情況下，HP的發(fā)病率不僅未降，反而逐年升高，提示存在其他重要的致病因素。本研究室將高血壓的病因追溯至生命早期(孕期)，選取脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為炎癥刺激劑，建立了孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代大鼠血壓升高的動物模型；在此模型

2、的基礎(chǔ)上，選取了核轉(zhuǎn)錄因子kappa-B(Nuclear factorkappa-B，NF-κB)這一炎癥通路上的關(guān)鍵靶點在母體孕期進(jìn)行干預(yù)，可以阻止子代出生后高血壓的發(fā)生。在此一系列實驗的基礎(chǔ)上，我們提出了假說：慢性成年疾病原發(fā)性高血壓的形成可能要追溯來自于孕期的炎癥刺激，即孕期的炎癥刺激能導(dǎo)致子代高血壓的發(fā)生。但關(guān)于其機(jī)制尚待深入闡明。
　　 影響血壓的因素復(fù)雜，其中血管系統(tǒng)既是血壓的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，又是高血壓的靶器官；尤其是近年

3、來觀察到自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)和腎性高血壓大鼠離體主動脈、股動脈、腎動脈、尾動脈和腸系膜動脈平滑肌對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性增高，與自發(fā)性高血壓和腎性高血壓的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。提示高血壓的發(fā)生與血管反應(yīng)性異常有密切關(guān)系。但孕期炎癥刺激致子代血壓升高大鼠的血管反應(yīng)性是否發(fā)生了變化？若有變化，有何特征及規(guī)律，以及其發(fā)生的機(jī)制等科學(xué)問題均有待闡明。
　　 為此，本課題擬通過

4、研究孕期炎癥刺激對子代大鼠血管反應(yīng)性的影響來研究子代大鼠血壓升高的機(jī)制，同時進(jìn)一步對影響血管反應(yīng)性的機(jī)制進(jìn)行研究。擬通過測定各組子代大鼠離體血管條對收縮劑去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)和舒張劑硝普鈉(Sodium Nitroprusside，SNP)的反應(yīng)性，明確孕期炎癥刺激對子代大鼠血管反應(yīng)性的影響；通過觀察子代大鼠血管局部AngⅡ及其AT1、AT2受體蛋白水平的變化，血管內(nèi)皮eNOS活性的變化，子代大鼠血管組織N

5、F-κB激活狀況以及血管組織炎癥因子水平，并同時給予NF-κB抑制劑PDTC觀察其逆轉(zhuǎn)情況來研究孕期炎癥刺激對子代大鼠血管反應(yīng)性影響的機(jī)制；旨在探索孕期炎癥刺激對子代大鼠血管反應(yīng)性的影響及初步機(jī)制，為深入探明高血壓的發(fā)病機(jī)制及尋找新的防治靶點提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.孕鼠分組及給藥
　　 孕鼠按照隨機(jī)數(shù)字表的方法隨機(jī)分為4組。正常對照組：在孕第8～14天每天腹腔注射無菌生理鹽水0.5ml；LPS模型

6、組：在孕第8、10、12天腹腔注射LPS0.79mg/kg，孕第9、11、13、14天給予生理鹽水；LPS+PDTC組：在孕第8、10、12天腹腔注射LPS0.79mg/kg，孕第8～14天每天腹腔注射PDTC100 mg/kg；PDTC組：在孕第8～14天，每天腹腔注射PDTC100 mg/kg。
　　 2.子代大鼠血壓的測量
　　 子代大鼠應(yīng)用尾套法測大鼠尾動脈血壓，時間均在測量當(dāng)天的上午8:00～12:00。每只子

7、鼠每隔3min測量一次，測3次，取平均值。
　　 3.子代大鼠血管反應(yīng)性的測定
　　 選用去甲腎上腺素(NE)作為收縮劑，硝普鈉(SNP)作為舒張劑，采用恒溫灌流系統(tǒng)，血管環(huán)離體測定的方法測定16周齡子代大鼠血管收縮和舒張反應(yīng)性。
　　 4.AngⅡ及其受體的蛋白水平測定
　　 采用免疫組織化學(xué)方法測定5周齡和16周齡子代大鼠血管組織AngⅡ蛋白水平；采用Western blotting方法測定5周齡和1

8、6周齡子代大鼠血管組織AngⅡ受體AT1和AT2蛋白水平。
　　 5.血管組織eNOS和p-eNOS蛋白水平測定
　　 采用免疫組織化學(xué)方法測定血管組織5周齡和16周齡eNOS和p-eNOS的蛋白水平。
　　 6.血管組織NF-κBp65蛋白水平及IL-6和TNF-α水平測定
　　 采用免疫組織化學(xué)方法測定血管組織5周齡和16周齡NF-κB p65的蛋白水平；采用ELISA方法測定血管組織5周齡和16周齡

9、的IL-6和TNF-α水平。
　　 結(jié)果
　　 1.孕期炎癥刺激對子代大鼠血壓的影響
　　 LPS模型組子代大鼠血壓與正常對照組相比較，在8周齡時出現(xiàn)顯著性升高(p<0.05)；12周齡直至16周齡時，血壓出現(xiàn)更顯著性升高(p<0.01)，孕期給予PDTC干預(yù)的子代大鼠的血壓水平較LPS組顯著性降低(p<0.05)。說明孕期LPS刺激致子代大鼠血壓升高模型復(fù)制成功，并且孕期LPS刺激的同時應(yīng)用NF-κB的抑制劑P

10、DTC逆轉(zhuǎn)了其對子代血壓升高的影響。
　　 2.孕期炎癥刺激對子代大鼠血管反應(yīng)性的影響
　　 (1)孕期炎癥刺激對子代大鼠血管收縮反應(yīng)性的影響
　　 ①當(dāng)NE濃度達(dá)到10-7mol/L時，LPS模型組血管收縮反應(yīng)性較正常對照組顯著性增大(p<0.05)，PDTC干預(yù)組較LPS模型組顯著性降低(p<0.01)；NE濃度達(dá)到10-6mol/L時，LPS模型組的收縮力較正常對照組顯著性增大(p<0.01)，PDTC干預(yù)

11、組較LPS模型組顯著性降低(p<0.01)。說明孕期炎癥刺激引起子代大鼠血管收縮反應(yīng)性顯著性增強(qiáng)，PDTC則可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
　　 ②子代大鼠血管的最大收縮反應(yīng)性：LPS組較對照組顯著性升高(p<0.01)，PDTC干預(yù)組較LPS模型組顯著性降低(p<0.01)。說明孕期炎癥刺激引起子代大鼠血管最大收縮反應(yīng)性顯著性增強(qiáng)，PDTC可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
　　 (2)孕期炎癥刺激對子代大鼠血管舒張反應(yīng)性的影響
　　 ①

12、孕期炎癥刺激子代大鼠血管的舒張反應(yīng)性隨著硝普鈉(SNP)濃度的增大而增大，LPS模型組增大趨勢較正常對照組緩慢，而PDTC干預(yù)組較LPS模型組增大趨勢加快，但均沒有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 ②子代大鼠胸主動脈的最大舒張反應(yīng)性：LPS組較對照組有降低趨勢，PDTC干預(yù)組較LPS模型組有升高趨勢，但均無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3.孕期炎癥刺激對子代大鼠血管AngⅡ及受體AT1和AT2的影響
　　 (1)子代大鼠5周

13、齡時血管組織AngⅡ蛋白水平：LPS模型組較正常對照組有升高趨勢，PDTC干預(yù)組較LPS模型組有降低趨勢，但均沒有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異；AngⅡ受體(AT1和AT2)的蛋白水平表達(dá)微弱，無法進(jìn)行統(tǒng)計。
　　 (2)子代大鼠16周齡時血管組織：LPS模型組較正常對照組AngⅡ蛋白水平顯著性升高(p<0.01)，AT1蛋白水平顯著性升高(p<0.05)，AT2的蛋白水平有降低趨勢，AT1/AT2蛋白水平顯著性升高(p<0.01)；PDT

14、C干預(yù)組較LPS模型組AngⅡ蛋白水平顯著性降低(p<0.01)，AT1蛋白水平有降低趨勢，AT2蛋白有升高趨勢，AT1/AT2蛋白表達(dá)水平顯著降低(p<0.05)。
　　 4.孕期炎癥刺激對子代大鼠血管局部eNOS和p-eNOS的影響
　　 (1)子代大鼠5周齡時，LPS模型組較正常對照組eNOS蛋白水平顯著性升高(p<0.01)，p-eNOS蛋白水平顯著性降低(p<0.05)，p-eNOS/eNOS蛋白水平顯著性降低

15、(p<0.01)。
　　 (2)子代大鼠16周齡時，LPS模型組較正常對照組eNOS蛋白水平有升高的趨勢，p-eNOS蛋白水平顯著性降低(p<0.05)，p-eNOS/eNOS蛋白水平顯著性降低(p<0.01)。
　　 5.孕期炎癥刺激對子代大鼠血管組織NF-κBp65及IL-6和TNF-α的影響
　　 (1)子代大鼠5周齡和16周齡時，LPS模型組較正常對照組NF-κBp65的蛋白水平均顯著性升高(p<0.01

16、)；PDTC干預(yù)組較LPS組均顯著性降低(p<0.01)。
　　 (2)子代大鼠5周齡時LPS模型組較正常對照組IL-6水平有升高趨勢，TNF-α水平也有升高趨勢，但均無統(tǒng)計學(xué)差異；PDTC干預(yù)組較LPS模型組IL-6水平著性降低(p<0.05)，TNF-α水平有降低趨勢。
　　 (3)子代大鼠16周齡時，LPS模型組較正常對照組IL-6水平有升高趨勢，TNF-α水平顯著性升高(p<0.01)；PDTC干預(yù)組較LPS模型

17、組IL-6水平有降低趨勢，TNF-α水平顯著性降低(p<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代大鼠出現(xiàn)以血管收縮性顯著增強(qiáng)為特征的血管反應(yīng)性異常。
　　 2.孕期炎癥刺激導(dǎo)致血管反應(yīng)性異常的機(jī)制可能與子代大鼠血管組織AngⅡ及其受體蛋白水平改變，eNOS活性改變，NF-κBp65激活有關(guān)。
　　 3.NF-κB在孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代大鼠血管反應(yīng)性異常中發(fā)揮了重要的作用，干預(yù)NF-κB，可