孕期炎癥刺激致子代大鼠心室重構(gòu)及機(jī)制的研究.pdf

1、近年來,炎癥在心血管疾病發(fā)病中重要作用的認(rèn)識(shí)是對(duì)高血壓的病因?qū)ふ抑凶钪匾倪M(jìn)展之一。本研究室將高血壓的病因追溯至母體孕期,選取脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)作為炎癥刺激劑,建立了孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代大鼠血壓升高的動(dòng)物模型;在此模型的基礎(chǔ)上,選取了炎癥通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)核轉(zhuǎn)錄因子kappa-B(Nuclear factor kappa-B, NF-κB)在母體孕期進(jìn)行干預(yù),可以有效阻止子代出生后高血壓的發(fā)生,但關(guān)于

2、其機(jī)制尚待深入闡明。心室重構(gòu)是高血壓、心力衰竭和心肌病等許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理生理過程,從病理生理學(xué)角度來說,一方面是心肌細(xì)胞發(fā)生代償性肥厚、細(xì)胞凋亡、壞死和增生;另一方面是心肌細(xì)胞外基質(zhì)膠原的沉積,膠原網(wǎng)的組成和含量的改變;最終引起心肌實(shí)質(zhì)和間質(zhì)比例的失衡,使心臟的結(jié)構(gòu)改變和功能失償。近年來研究認(rèn)為,神經(jīng)內(nèi)分泌因子的過度激活在心室重構(gòu)病程的發(fā)生、發(fā)展中極為重要,其中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin s

3、ystem, RAS)則發(fā)揮著尤為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),RAS系統(tǒng)中除了 ACE-AngⅡ-AT1R通路以外,還存在著與其作用相拮抗的另外一條通路即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-血管緊張素(1-7)-Mas受體軸(Angiotensin converting enzyme2-Angiotensin(1-7)-Mas axis),ACE2-Ang(1-7)-MasR軸,此條通路通過ACE2降解AngⅡ,其在高血壓、心力衰竭的防治及改善心肌纖維化等方面

4、均得到了證實(shí)。我室前期研究發(fā)現(xiàn),與循環(huán) RAS系統(tǒng)變化不明顯相比,腎小球數(shù)量減少和腎功能的下降的同時(shí)存在腎臟局部RAS系統(tǒng)的明顯激活。在脂肪RAS系統(tǒng)中也得到了相同的結(jié)論,提示局部組織 RAS系統(tǒng)的變化可能是高血壓發(fā)病的另一重要原因之一。在我室研究中還發(fā)現(xiàn)孕期炎癥刺激會(huì)引起子代大鼠心室肌發(fā)生凋亡和重構(gòu),且這種重構(gòu)的發(fā)生早于高血壓的發(fā)生,提示子代的心室重構(gòu)是引起高血壓發(fā)生的機(jī)制之一。但子代大鼠哪些因子的變化引起了心室重構(gòu)的發(fā)生?以及孕期炎

5、癥刺激對(duì)子代大鼠心臟局部RAS系統(tǒng)是否產(chǎn)生影響?其規(guī)律和特征是什么等尚待進(jìn)一步研究。
　　本課題擬通過觀察心肌組織膠原的變化,膠原代謝酶MMP-2、TIMP-2及促纖維化因子TGFβ-1、TGFβ-2的變化來研究心肌發(fā)生纖維化及心肌重構(gòu)。并通過觀察子代大鼠心臟局部 RAS系統(tǒng)上兩條代謝通路即 ACE-AngⅡ-AT1R通路和 ACE2-Ang(1-7)-MasR通路的變化,進(jìn)一步了解孕期炎癥刺激后子代大鼠發(fā)生心肌纖維化及心肌間質(zhì)重

6、構(gòu)的機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法:
　　1.孕鼠分組及給藥:將SD孕鼠采用完全隨機(jī)法分為3組。正常對(duì)照組:在孕第8~14天每天腹腔注射無菌生理鹽水0.5ml;LPS模型組:在孕第8、10、12天腹腔注射LPS0.79mg/kg,孕第9、11、13、14天給予生理鹽水;LPS+PDTC組:在孕第8、10、12天腹腔注射LPS0.79mg/kg,孕第8~14天每天腹腔注射PDTC100 mg/kg。
　　2.稱重指標(biāo)的測(cè)定:子

7、大鼠每周進(jìn)行體重(body weight,BW)的測(cè)定,三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在6周齡和16周齡時(shí)麻醉,打開腹腔,快速取出心臟,置于冰凍無菌生理鹽水中洗凈后,濾紙吸干水分稱重,天平稱量心臟重量(heart weight,HW)。
　　3.用天狼星紅及 Masson膠原染色觀察心肌膠原形態(tài)學(xué)及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)的變化。
　　4.免疫組織熒光的方法檢測(cè)6周齡和16周齡子代大鼠心肌組織AngⅡ及Mas受體蛋白水平;
　　5.免疫組織化學(xué)

8、方法檢測(cè)6周齡和16周齡心肌組織中AT1受體的蛋白表達(dá)。
　　6.采用Real-time PCR測(cè)定6周齡和16周齡子大鼠心臟組織中ACE、ACE2、AT1R、MasR、MMP-2、TIMP-2、TGFβ-1及TGFβ-2 mRNA基因表達(dá)水平。
　　7.采用Western blotting方法測(cè)定6周齡和16周齡子代大鼠心肌組織ACE、ACE2、MMP-2、TIMP-2、TGFβ-1及TGFβ-2的蛋白含量;
　　結(jié)

9、果:
　　1.孕期炎癥刺激對(duì)子代大鼠發(fā)生心室重構(gòu)的影響
　　(1)孕期炎癥刺激對(duì)子代大鼠心臟指數(shù)的影響
　　與對(duì)照組相比,子代大鼠6周齡時(shí),LPS組心臟重量、心臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.05),PDTC干預(yù)后明顯下降(P<0.05);子代大鼠16周齡時(shí),LPS組較對(duì)照組心臟重量、心臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.05),PDTC干預(yù)后顯著性降低(P<0.01),LPS組體重明顯升高(P<0.05);差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、r>　　(2)孕期炎癥刺激對(duì)子代大鼠膠原蛋白的影響
　　天狼星紅及Masson染色結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,6w、16w,LPS組沉積在心肌間質(zhì)的膠原表達(dá)明顯增多;L+P組,紅色膠原表達(dá)較LPS組減少。
　　(3)孕期炎癥刺激對(duì)子代大鼠心肌組織MMP-2、TIMP-2、TGFβ-1及TGFβ-2 mRNA水平的影響
　　子代大鼠6周齡時(shí),與正常對(duì)照組相比,LPS組TGFβ-1 mRNA表達(dá)顯著性升高(P<0.01);

11、TGFβ-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),PDTC干預(yù)后顯著性降低(P<0.01);LPS組MMP-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05);TIMP-2 mRNA表達(dá)顯著性升高(P<0.01)。子代大鼠16周齡時(shí),LPS組較正常對(duì)照組TGFβ-1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05),PDTC干預(yù)后明顯降低(P<0.05);TGFβ-2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05);TIMP-2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.0

12、5)PDTC干預(yù)后顯著性降低(P<0.01);MMP-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。
　　(4)孕期炎癥刺激對(duì)子代大鼠心肌組織MMP-2和TIMP-2蛋白水平的影響
　　子代大鼠6w、16w,LPS模型組較正常對(duì)照組MMP-2蛋白水平顯著性降低(P<0.05);TIMP-2蛋白水平顯著性升高(P<0.05);LPS組 TIMP2-/MMP-2的蛋白水平比值顯著升高(P<0.05),PDTC干預(yù)后蛋白水平明顯降低(

13、P<0.05)。
　　(5)孕期炎癥刺激對(duì)子代大鼠心肌組織TGFβ-1和TGFβ-2蛋白水平的影響
　　子代大鼠6w、16w,LPS模型組較正常對(duì)照組TGFβ-1的蛋白水平明顯升高(P<0.05), PDTC干預(yù)后明顯降低(P<0.05);TGFβ-2的蛋白水平明顯升高(P<0.05)。
　　2.孕期炎癥刺激對(duì)子代大鼠心臟局部RAS系統(tǒng)的影響
　　(1)免疫組織熒光測(cè)定子代大鼠心肌組織中AngⅡ:LPS組較對(duì)照組

14、熒光強(qiáng)度及熒光點(diǎn)明顯增強(qiáng),L+P組較LPS組減少;MasR蛋白表達(dá)水平LPS組較對(duì)照組熒光強(qiáng)度明顯減弱,熒光點(diǎn)明顯減少,L+P組紅色熒光區(qū)較LPS組增多。
　　(2)免疫組織化學(xué)測(cè)定子代大鼠心肌組織中AT1R蛋白水平:對(duì)照組,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核著色)少,LPS組,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核著色)明顯增多,L+P組,陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞核著色)較LPS組減少。
　　(3)Real time PCR檢測(cè)子代大鼠心肌組織ACE、ACE2、Mas

15、R及AT1R mRNA水平
　　子代大鼠6周齡時(shí),與正常對(duì)照組比,LPS組ACE mRNA表達(dá)有升高趨勢(shì),PDTC干預(yù)后明顯降低(P<0.05);AT1R mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05); MasR mRNA表達(dá)顯著性降低(P<0.01),PDTC干預(yù)后顯著性升高(P<0.01)。子代大鼠16周齡時(shí),與正常對(duì)照組比, LPS組較 ACE mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05), PDTC干預(yù)后顯著降低(P<0.01)AT1R

16、mRNA表達(dá)顯著性升高(P<0.01),PDTC干預(yù)后明顯降低(P<0.05);MasR、ACE2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　(4)Western blotting檢測(cè)子代大鼠心肌組織ACE和ACE2蛋白水平
　　子代大鼠6w、16w,LPS模型組較正常對(duì)照組ACE蛋白水平顯著性升高(P<0.05), PDTC干預(yù)后明顯降低(P<0.05);LPS組 ACE2蛋白水平顯著性降低(P<0.05);LPS組AC

17、E/ACE2的蛋白水平比值顯著升高(P<0.05),PDTC干預(yù)后明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代大鼠發(fā)生心室重構(gòu),NF-κB的抑制劑 PDTC能有效逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。
　　2.孕期炎癥刺激可引起子代大鼠發(fā)生基質(zhì)金屬蛋白酶及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制酶表達(dá)失衡,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2表達(dá)增加,膠原代謝異常,從而引起心肌纖維化,促進(jìn)了心室重構(gòu)的發(fā)生。
　　3.孕期炎癥刺激一方面