孕期炎癥刺激致子代小鼠肥胖的機制研究.pdf

1、目的：
　　本論文從脂肪代謝調節(jié)因子FAT/CD36與炎癥免疫因子PTX3的角度出發(fā)，去探討炎癥和肥胖之間的通路調節(jié)機制，以期為炎癥與肥胖之間的關系做進一步的研究。
　　方法:
　　1.孕期炎癥刺激對子代小鼠脂肪發(fā)育、脂質代謝及FAT/CD36表達量的影響
　　1.1 從第三軍醫(yī)大學動物房購買C57小鼠于SPF級環(huán)境下正常飼養(yǎng)至8周齡，雌鼠體重(20±2)g，雄鼠體重(25±2)g，于第一天下午18:00按照雌∶

2、雄=2∶1的比例同籠配種，第二天早上7:00分籠飼養(yǎng)，并記錄各籠小鼠體重，記為在孕0天，于第十一天時稱量孕鼠體重，若與在孕0天相比，體重增加大于2g且觀察小鼠腹部出現(xiàn)明顯隆起，則確定懷孕。
　　1.2 將確定懷孕的孕鼠隨機分為2組，對照組NS:在孕第11天腹腔一次性注射無菌生理鹽水0.2ml;LPS組:在孕第11天一次性腹腔注射LPS75μg.kg-1，懷孕以后取子代小鼠作為研究對象，構建孕期炎癥子代小鼠模型。
　　1.3

3、兩組子代小鼠從出生開始（設為第0天）進行體重監(jiān)測，每2w測量一次體重（g)直到12w并于4w、8w和12w分別取樣，稱取脂肪濕重(g)，并計算脂肪系數(shù)(脂肪系數(shù)=脂肪濕重/體重×100)，測量母體孕期炎癥刺激對子代小鼠脂肪發(fā)育的影響。
　　1.4 通過眼球取血，分別在4w、8w和12w時獲取子代雄鼠的血液樣本，通過試劑盒分別檢測雄鼠血液中游離脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)含量。
　　1.5 子代雄鼠于4w、8w和12w取

4、雄鼠附睪脂肪組織，通過試劑盒分別檢測雄鼠脂肪組織中游離臘肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)含量。
　　1.6 Real-time PCR法和Western Blot方法分別檢測子代雄鼠附睪脂肪中FAT/CD36mRNA表達水平和蛋白的表達水平。
　　1.7 Real-time PCR檢測誘導分化3T3-L1細胞中mRNA表達水平和Western Blot法檢測誘導分化3T3-L1細胞中FAT/CD36含量的蛋白表達水平。

5、>　　2.孕期炎癥刺激對子代小鼠肥胖的機制研究
　　2.1 子代雄鼠于4W、8W和12W取附睪脂肪組織，通過通過Real-time PCR法和Western Blot方法檢測PTX3mRNA和蛋白水平表達量。
　　2.2 Real-time PCR法和Western Blot方法分別檢測子代雄鼠附睪脂肪組織中脂肪分化標志物(aP2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)mRNA水平和蛋白水平表達量。
　　2.3 轉染

6、siRNA和過表達PTX3質粒對3T3-L1細胞中PTX3、脂肪分化標志物(aP2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)mRNA水平和脂肪分化標志物蛋白水平表達量影響。
　　2.4 流式細胞技術檢測轉染siRNA和過表達PTX3質粒對3T3-L1細胞凋亡的影響。
　　2.5 MTT法檢測轉染siRNA和過表達PTX3質粒對3T3-L1細胞的增殖的影響。
　　2.6 油紅染色檢測轉染siRNA和過表達PTX3質粒對3

7、T3-L1細胞分化的影響。
　　2.7 Western Blot方法檢測子代雄鼠附睪脂肪組織中MAPK通路相關蛋白的相對表達量。
　　結果:
　　1.孕期炎癥刺激對子代小鼠脂肪發(fā)育的影響
　　1.1 與NS組相比，LPS組各周齡雄鼠體重、附睪脂肪濕重及4W、8W附睪脂肪系數(shù)均增加，差異具有顯著性(p＜0.05)(Fig.1-3);8W、12W子代雌鼠體重、4W、8W、12W子代雌鼠腎周脂肪濕重及8W、12W腎周脂

8、肪系數(shù)均增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig.1-3)。
　　1.2 與NS組相比，LPS組4w、8w、12w子代雄鼠血液中的FFA表達量顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(p＜0.05)(Fig.4A);LPS組子代雄鼠血液中8w、12w TG含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig4B)。
　　1.3 與NS組相比，LPS組4w、8w、12w子代雄鼠脂肪組織中的FFA含量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p

9、＜0.05)(Fig.5A);LPS組子代雄鼠脂肪組織中8w、12w TG含量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig.5B)。
　　1.4 與NS組相比，LPS組子代雄鼠附睪脂肪組織中FAT/CD36mRNA水平表達量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig.6);LPS組雄鼠附睪脂肪組織中4w、8wFAT/CD36蛋白水平表達量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig.7)。
　　1.

10、5 與正常組相比;誘導的3T3-L1細胞中FAT/CD36mRNA水平表達量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)(Fig.8);誘導的3T3-L1細胞中FAT/CD36蛋白水平表達量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)(Fig.9)。
　　2.孕期炎癥刺激對子代小鼠肥胖的機制研究
　　2.1 與NS組相比，LPS組PTX3mRNA水平和蛋白水平表達量均顯著升高(p＜0.05)(Fig.10)。
　　2.

11、2 與NS組相比，4W CEBP/α、CEBP/β、PPARγ和8W CEBP/α、PPARγ以及12WCEBP/β、aP2、PPARγ子代小鼠脂肪分化標志物mRNA水平和蛋白水平表達量均顯著升高(p＜0.05)(Fig.11)。
　　2.3 在轉染siRNA的3T3-L1細胞中，與NS組相比，炎癥因子PTX3、脂肪分化標志物(CEBP/α、aP2)的表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig.12);在過表達PT

12、X3質粒的細胞中，與Control組相比，過表達PTX3質粒的3T3-L1前脂肪細胞脂肪分化標志物(aP2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.0S)(Fig.12)。
　　2.4 與NS組組相比，過表達組對3T3-L1細胞凋亡沒有顯著影響，抑制表達PTX3顯著降低3T3-L1細胞的凋亡(p＜0.05)(Fig.13A)。
　　2.5 與NS組相比，過表達組與抑制表達組對3T3

13、-L1細胞周期沒有顯著影響(p＞0.05)(Fig.13B)。
　　2.6 油紅染色的結果顯示，過表達PTX3組中，細胞的分化為成熟細胞的程度和數(shù)量顯著增加，抑制表達組細胞的分化程度和數(shù)量顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig.13C)。
　　2.7 與對照組相比，過表達組與抑制表達組對3T3-L1細胞的增殖沒有顯著影響(p＞0.05)(Fig.13D)。
　　2.8 與NS組相比，LPS組子代雄鼠脂肪組

14、織中的非磷酸化MAPK(P38、JNK、ERK1/2)相關蛋白4W ERK1/2(P42/P44)、JNK/SNPK(P46/P54)、8W ERK1/2(P42/P44)以及12W JNK/SNPK(P46/P54)含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)(Fig.14A-C);磷酸化MAPK(p-P38、p-JNK/SNPK、p-ERK1/2)相關蛋白p-P38、p-JNK/SNP K(p-P42/P44)、p-ERK1/2

15、(p-P46/P54)含量顯著升高(p＜0.05)(Fig.14D-F)。
　　結論:
　　1.在給予母代孕鼠一次性孕期LPS炎癥刺激以后，子代小鼠出現(xiàn)了以體重增加、脂肪濕重增加、脂肪系數(shù)變大且血液中和脂肪組織中FFA和TG含量異常增多的脂質代謝紊亂現(xiàn)象，并且在誘導分化的3T3-L1細胞中，F(xiàn)AT/CD36的表達量較正常組也顯著升高，提示在孕期炎癥導致子代小鼠脂質代謝紊亂過程中，F(xiàn)AT/CD36具有重要的作用。
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