孕鼠暴露于炎癥、免疫刺激劑誘發(fā)子代高血壓機(jī)制研究：發(fā)病相關(guān)候選基因的篩選.pdf

1、原發(fā)性高血壓(essentialhypertension，EH)是最常見(jiàn)的心血管疾病，其并發(fā)癥是造成人類(lèi)死亡的主要原因之一。探索EH的發(fā)病機(jī)制、尋找EH的防治方法有極其重要的意義。炎癥在心血管疾病發(fā)病中重要作用的認(rèn)識(shí)是近年來(lái)該領(lǐng)域最重要的進(jìn)展之一。更為有趣的是，越來(lái)越多的臨床流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提示高血壓在某些方面也與炎癥密切相關(guān)。我室近年研究發(fā)現(xiàn)，孕鼠暴露于炎癥刺激劑LPS或免疫刺激劑zymosan后，可導(dǎo)致仔鼠出生后血壓升高、體重增加；

2、近年發(fā)育生物學(xué)提出“成人慢性病的胎源性學(xué)說(shuō)”，即成人一些慢性疾病如冠心病、Ⅱ型糖尿病、高血壓等的病因源于胚胎及嬰幼兒時(shí)期發(fā)育的可塑性，也就是在妊娠期間，始兒受到來(lái)自外界環(huán)境的刺激會(huì)對(duì)其發(fā)育產(chǎn)生影響，并可能對(duì)其成年后發(fā)生一些慢性疾病起重要作用，這一理論正與我們的研究發(fā)現(xiàn)相吻合。但究竟這種炎癥免疫刺激因素是通過(guò)那一些因子和途徑來(lái)引起胎兒發(fā)育上的改變導(dǎo)致仔鼠成年后發(fā)生血壓升高和體重增加，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究擬在我室原有的研究工作

3、的基礎(chǔ)上，探討炎癥免疫刺激因素是如何影響胎兒的發(fā)育，研究炎癥免疫刺激孕鼠對(duì)胚胎全基因表達(dá)的影響，旨在探索仔鼠高血壓發(fā)病相關(guān)的候選基因，為進(jìn)一步深入了解其分子機(jī)制和尋找有效干預(yù)措施提供新線索和理論依據(jù)。 方法： 1.SD孕鼠，在妊娠8、10、12天，分別腹腔注射0.79mg/kgLPS、8mg/kgzymosan為炎癥免疫刺激模型，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水。 2.在最后一次注射后2小時(shí)鼠尾取血，及取最后一次注射后2h

4、、12h、24h及48h的羊水混合，用放免法檢測(cè)血清及羊水的TNF-α及IL-6水平。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析胎盤(pán)、羊膜、羊水中細(xì)胞、胚胎及腹腔巨噬細(xì)胞中的TNF-α及IL-6mRNA水平。 4.Affymetrix的大鼠全基因組芯片研究炎癥免疫刺激模型與正常對(duì)照之間胚胎的基因表達(dá)譜的變化。 5.基因芯片數(shù)據(jù)采用GeneOnology分析生物學(xué)功能，采用GenMAPP2.1軟件分析信號(hào)通路。GO分析我們重點(diǎn)放

5、在分子功能分析上。 6.選擇了20個(gè)基因采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，并研究這些基因在胚胎不同時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)變化情況。 結(jié)果與結(jié)論： 1.應(yīng)用孕鼠腹腔注射LPS、zymosan，血清TNF-α、IL-6水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，說(shuō)明在LPS和Zym組，母鼠均發(fā)生了炎癥免疫反應(yīng)：TN-αmRNA水平在巨噬細(xì)胞中表達(dá)最多，3h時(shí)是其它組織的上千倍；IL-6mRNA在巨噬細(xì)胞中表達(dá)最多，2h時(shí)是其它

6、細(xì)胞的幾十萬(wàn)倍。說(shuō)明炎性因子TNF-αIL-6主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞一類(lèi)炎性細(xì)胞。 2.在胚胎中TNF-αmRNA的量較低，而IL-6mRNA的量較其他幾種組織中高，并且炎癥刺激組在24h及48h兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)要明顯高于對(duì)照組數(shù)十倍，提示IL-6與大鼠妊娠期注射炎癥免疫刺激劑引起仔代大鼠血壓升高有關(guān)；在羊膜、羊水及胎盤(pán)中LPS組明顯高于對(duì)照組，而Zym組則僅在胎盤(pán)中變化明顯，提示兩種炎癥免疫刺激劑作用路徑不盡相同，LPS可以通過(guò)影響羊膜

7、，羊水及胎盤(pán)的細(xì)胞因子變化而影響胚胎發(fā)育；zymosan則主要通過(guò)胎盤(pán)影響胚胎的發(fā)育。 3.用大鼠全基因芯片從28000個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)孕鼠注射炎癥、免疫刺激劑后胚胎的差異表達(dá)基因：LPS組上調(diào)(Ratio≥2)的有183個(gè)、下調(diào)(Ratio≤0.5)的有270個(gè)；Zym組上調(diào)(Ratio≥2)的有144個(gè)、下調(diào)(Ratio≤0.5)的有417個(gè)。LPS組及Zym組中同向變化的基因，上調(diào)的有50個(gè)，其中功能已知的基因有10個(gè)(Tnn

8、t2，Argl，F(xiàn)gf8，Dusp9，Plekhf1，Soat1，F(xiàn)ubp1，Orc11，Hmga1，Nr2f6)；下調(diào)的有173個(gè)，其中功能已知的基因有85個(gè)。 4.GeneOntology功能檢索，差異表達(dá)基因數(shù)量較多的功能分類(lèi)集中在結(jié)合分子、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等幾個(gè)方面，涉及生長(zhǎng)因子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子，直接參與代謝的酶，肌鈣蛋白等。其中表達(dá)下調(diào)的基因比表達(dá)上調(diào)的多，這種胚胎期的基因表達(dá)下調(diào)可

9、能會(huì)影響仔鼠以后的發(fā)育。 5.GenMAPP信號(hào)通路的可視化分析，發(fā)現(xiàn)在DNA合成、RNA加工、細(xì)胞G1期到S期調(diào)控及翻譯因子方面，有差異表達(dá)的基因基本是都是上調(diào)，而且在LPS組及Zym組中呈高度的一致性；在心肌鈣調(diào)節(jié)、平滑肌收縮舒張通路及炎癥反應(yīng)通路中則下調(diào)的基因較多。 6.選擇了20個(gè)差異表達(dá)基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。在12h時(shí)與基因芯片數(shù)據(jù)一致的有13個(gè)、不一致的有4個(gè)，還有RGDl307

10、150、Bcllla及Tgfb2三個(gè)基因的Zym組與芯片結(jié)果一致。 7.各基因的mRNA含量變化中：Fgf8、Orcll在2h及12h時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組出現(xiàn)了上調(diào)，24h到48h逐漸降到對(duì)照組同一水平；Bcllla、Dusp9表現(xiàn)與上述相反；Nfib的mRNA水平在實(shí)驗(yàn)組中各時(shí)相點(diǎn)均有不同程度的下調(diào)；Egfr、Gap43及Penkl的mRNA水平在2h時(shí)三個(gè)組相差不明顯，在12h到48h實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)；Agtr2在12

11、h時(shí)實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組；Tgfb2在Zym組各時(shí)相點(diǎn)都有下調(diào)，而LPS組則沒(méi)有。 結(jié)合各基因功能分析：Fgf8、Orcll、Bcllla的表達(dá)變化可能與炎癥免疫刺激后胚胎的急性期調(diào)節(jié)有關(guān)；Nfia、Nfib及Gap43的表達(dá)下調(diào)可能與炎癥免疫刺激對(duì)胚胎腦發(fā)育的影響有關(guān)；Agtr2的表達(dá)下調(diào)可能會(huì)對(duì)仔鼠腎臟的發(fā)育產(chǎn)生一定的影響；Dusp9、Egfr、Ripx及Tgfb2等的表達(dá)變化可能與炎癥免疫刺激對(duì)胚胎細(xì)胞增殖分化的影響有關(guān)。