經(jīng)口急性砷暴露誘發(fā)小鼠肺臟免疫炎癥反應(yīng)及其可能機(jī)制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  砷是一種有毒的類金屬元素,廣泛存在于地殼、土壤、海水、大氣和食物中。早在1987年,砷及其化合物就被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(international agency forresearch on cancer,IARC)確認(rèn)為人類Ⅰ類致癌物,損傷機(jī)體多種組織、器官或系統(tǒng)。砷作為一種全身性毒物,慢性飲水無機(jī)砷暴露可以引起皮膚過度角化、色素沉著、神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及皮膚、膀胱、肺、肝等實(shí)質(zhì)器官腫瘤,此外還與糖尿病、心腦血管疾病等發(fā)病

2、風(fēng)險的增加有關(guān)。砷的廣泛分布及其對機(jī)體造成的許多不良影響,使得砷暴露對人類健康的危害已經(jīng)成為世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
  呼吸道吸入砷作為職業(yè)性砷暴露的重要途徑,主要集中在一些農(nóng)業(yè)和工業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū),沿海地區(qū)主要是通過水生食物攝入有機(jī)砷,而通過飲水方式攝入則是廣大砷病區(qū)人群無機(jī)砷暴露的最主要途徑。有趣的是,無論是呼吸道吸入還是消化道攝取,流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)無機(jī)砷暴露都可以誘導(dǎo)肺癌高發(fā),其主要取決于無機(jī)砷的吸入/攝入劑量。無論何種

3、途徑的砷暴露都使得肺組織成為砷毒性最敏感的器官之一,長期飲水砷暴露與肺癌發(fā)病率之間存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。此外,越來越多的證據(jù)表明長期接觸無機(jī)砷還會降低肺功能、增加罹患肺部疾病的風(fēng)險,增加支氣管擴(kuò)張。尤其在胎兒、嬰兒時期砷暴露,會明顯增加肺部機(jī)會性致病菌感染風(fēng)險,引起肺結(jié)核、呼吸道感染等疾病的發(fā)生,表現(xiàn)為炎癥、不可逆性支氣管損傷以及呼吸衰竭等。
  砷暴露還被證實(shí)可活化一些轉(zhuǎn)錄因子,例如AP-1、HIFs、NF-κB以及Nrf2

4、等,這些轉(zhuǎn)錄因子都參與各種炎癥介質(zhì)的合成及其生理調(diào)控。NF-κB作為調(diào)控炎癥反應(yīng)的經(jīng)典信號通路,研究表明無機(jī)砷暴露使IκB磷酸化,激活NF-κB,啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)炎性介質(zhì)(IL-1β、IL-6和TNF-α)的分泌,在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。也有報道稱在砷暴露誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中,MAPK信號通路,主要是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基未端激酶

5、(c-Jun N-Terminal kinase,JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,P38MAPK),參與調(diào)節(jié)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮其對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。有研究表明,P38MAPK的激活可以使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性介質(zhì),與JNK一起通過c-jun磷酸化激活A(yù)P-1,進(jìn)而調(diào)控IL-6和TNF-α的釋放。磷酸化的P38和JNK表達(dá)降低時可抑制促炎細(xì)胞因子的IL-1β

6、、IL-6和TNF-α分泌。
  綜上所述,目前針對砷誘導(dǎo)肺炎癥反應(yīng)的研究主要集中在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),少數(shù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究也主要采用氣道吸入式染毒,模擬人群飲水砷暴露方式的經(jīng)口砷暴露的整體動物實(shí)驗(yàn)尚未見報道。砷暴露誘導(dǎo)肺組織免疫/炎癥反應(yīng)相關(guān)作用機(jī)理亦尚不清楚。本研究以亞砷酸鈉(sodium arsenite,NaAsO2)為處理因素,觀察經(jīng)口急性無機(jī)砷暴露對C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage flu

7、id,BALF)及肺組織的炎癥反應(yīng)、Th1/Th2細(xì)胞因子和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及MAPK、Nrf2等信號通路的可能影響,試圖探討飲水砷暴露誘發(fā)小鼠肺免疫炎性反應(yīng)及其可能機(jī)制,為深入研究無機(jī)砷致肺部疾病和肺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
  方法:
  1、實(shí)驗(yàn)動物與分組:
  健康C57BL/6雌性小鼠100只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將小鼠按體重隨機(jī)按數(shù)字表分組。采用一次性灌胃方式染毒,染毒濃度分別為2.5 mg/kg、5 m

8、g/kg和10mg/kg NaAsO2,對照組采用生理鹽水灌胃,染毒時間分別為6、12、24 h,共計(jì)10組,每組10只。染毒期間各組小鼠均喂養(yǎng)普通飼料。染毒終點(diǎn),眼球取血,提取BALF并摘取肺組織,部分甲醛固定,用于病理實(shí)驗(yàn);部分保存于-80℃?zhèn)溆谩?br>  2、檢測指標(biāo)與方法:
  (1)肺組織砷含量測定:高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子吸收測定法
  (2)肺組織病理改變:采用HE染色的方法
  (3)BALF中

9、細(xì)胞數(shù)目和形態(tài):Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)和Diff-Quik染色
  (4)BALF中蛋白濃度和細(xì)胞因子含量的檢測:采用BCA試劑盒和ELISA檢測試劑盒
  (5)肺組織氧化應(yīng)激檢測:采用南京建成公司試劑盒測定肺組織MDA含量、GSH-Px和CAT活力
  (6)肺組織炎性損傷檢測:采用南京建成公司試劑盒測定肺組織MPO活力;RT-PCR法檢測肺組織中Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子(T-bet、IL-2、IFN-γ、G

10、ATA-3、IL-4、IL-10)和炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和MIP-2)基因的mRNA表達(dá)水平
  (7)肺組織MAPK和Nrf2信號通路蛋白表達(dá)水平:采用Western-Blot方法
  結(jié)果:
  1、經(jīng)口急性砷暴露小鼠肺組織臟器系數(shù)和總砷含量
  與對照組比,各NaAsO2染毒組小鼠肺組織重量和臟器系數(shù)無明顯改變;肺組織中總砷含量隨NaAsO2染毒劑量增加而增加,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,在6h達(dá)到最高

11、,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
  2、經(jīng)口急性砷暴露小鼠的肺臟組織病理情況
  對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞形態(tài)正常,肺泡腔明亮無積液,2.5 mg/kg和5 mg/kg NaAsO2染毒組小鼠肺組織未見明顯異常,只有10 mg/kg染毒組小鼠肺泡腔結(jié)構(gòu)遭到輕微的破壞,少部分肺泡塌陷,上皮細(xì)胞排列不均勻,偶見炎性細(xì)胞,并未見到肺泡腔內(nèi)積液和出血。
  3、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠BALF炎性相關(guān)功能指標(biāo)的影響<

12、br>  (1)經(jīng)口急性砷暴露小鼠BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
  與對照組相比,各NaAsO2染毒組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯增多;淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)目和所占百分比也隨之增加,巨噬細(xì)胞數(shù)目表現(xiàn)出增加趨勢但其所占比有所降低,可能是由于炎癥反應(yīng)的發(fā)生,淋巴細(xì)胞聚集和中性粒細(xì)胞趨化作用增強(qiáng)所致。
  (2)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠BALF中蛋白濃度影響
  與對照組相比,6h、12h和24h的10 mg/kg NaAsO2染毒組

13、小鼠BALF中蛋白濃度顯著升高;24h的5 mg/kg和10 mg/kg NaAsO2染毒組小鼠BALF中蛋白濃度明顯增多,且差異具有顯著性(p<0.05)。
  (3)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠BALF中細(xì)胞因子含量的影響
  與對照組相比,2.5 mg/kg、5 mg/kg和10 mg/kg NaAsO2染毒組小鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均升高,以TNF-α升高最突出,差異具有顯著性(p<0.05)。

14、r>  4、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響
  (1)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織MPO活性的影響
  與對照組相比,急性砷暴露小鼠肺組織中MPO活性在5和10 mg/kg NaAsO2暴露組明顯增加,差異具有顯著性(p<0.05)。
  (2)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)影響
  與對照組相比,各染毒組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞因子(MIP-2、IL-1β、IL-6)mRNA表達(dá)水平顯著

15、升高,差異具有顯著性(p<0.05)。
  (3)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織Th1/Th2細(xì)胞因子mRNA水平的影響
  與對照組相比,NaAsO2染毒組小鼠肺組織中Th1轉(zhuǎn)錄因子(T-bet)和相關(guān)細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ) mRNA表達(dá)水平有所降低,而肺組織中Th2轉(zhuǎn)錄因子(GATA-3)和相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)mRNA表達(dá)明顯升高,差異具有顯著性(p<0.05)。
  5、經(jīng)口急性砷暴露小鼠肺

16、組織氧化應(yīng)激情況
  與對照組相比,小鼠肺組織MDA含量隨著NaAsO2染毒劑量的增加而增加,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,同時GSH-Px和CAT活力與對照組相比明顯降低,差異具有顯著性(p<0.05)。
  6、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織MAPK通路及下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的影響
  與對照組比,NaAsO2染毒組磷酸化P38和JNK蛋白表達(dá)水平明顯增加,差異具有顯著性(p<0.05);而磷酸化ERK蛋白表達(dá)水平幾乎不變,可能

17、是由于P38和JNK主要在炎癥以及凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用,而ERK優(yōu)先調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化。此外,急性砷暴露明顯增加MAPK下游調(diào)控因子NF-κB的蛋白水平,差異具有顯著性(p<0.05)。
  7、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織Nrf2通路及下游轉(zhuǎn)錄因子影響
  與對照組比,各NaAsO2染毒組,NRF2蛋白和mRNA表達(dá)水平均增加并在5mg/kg時達(dá)到最高,差異均具有顯著性(p<0.05);此外,Nrf2所調(diào)控的下游抗氧化

18、酶(HO-1)和Ⅱ相解毒酶(GSTO1/2)蛋白表達(dá)水平均明顯增加,Hmox-1、Gsto1mRNA表達(dá)水平也呈現(xiàn)增加趨勢,且差異均具有顯著性(p<0.05)。
  結(jié)論:
  1、經(jīng)口急性砷暴露引起小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)、蛋白濃度、促炎細(xì)胞因子含量的增加。
  2、經(jīng)口急性砷暴露誘導(dǎo)小鼠肺組織免疫/炎癥反應(yīng)、Th1/Th2比例失衡和氧化應(yīng)激。
  3、經(jīng)口急性砷暴露激活小鼠肺組織MAPK通路及下游轉(zhuǎn)錄因子N

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