肺臟來源的exosome參與肺臟免疫平衡維持的功能及其機制研究.pdf

1、人體每天經(jīng)呼吸道吸入大量外界環(huán)境中的抗原性物質(zhì)，而進入呼吸道系統(tǒng)中的各種外界環(huán)境抗原均有可能誘發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強烈的排異反應。然而正常情況下，呼吸道卻始終能夠處于一種相對的免疫平衡狀態(tài)，說明肺臟可以通過某些精細調(diào)節(jié)誘導對外來抗原的免疫耐受，從而維持肺臟的相對免疫平衡狀態(tài)。隨著人類長期的進化，我們的免疫系統(tǒng)逐漸形成了幾種有效的方式維持機體對一些外來無害抗原的免疫耐受，包括克隆失能、克隆忽略和通過調(diào)節(jié)性T細胞分泌IL-10及TGF-β1等

2、抑制性細胞因子防止免疫效應細胞的活化等。而一旦肺臟免疫耐受平衡被打破會導致呼吸道相關的自身免疫性疾病，比如哮喘。哮喘是最常見的呼吸道免疫失衡性疾病之一，目前認為Th1/Th2細胞之間平衡的紊亂是哮喘最主要的發(fā)病機制，免疫失衡是哮喘重要的發(fā)病基礎，而對呼吸道免疫耐受形成機制的深入研究也可以為哮喘的治療提供新的思路。
　　Exosome是各種活細胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結構的小囊泡，其直徑主要介于30-100nm之間，密度范圍從1.1

3、2g/ml到1.21g/ml。目前已經(jīng)有很多文獻證實，exosome在促進免疫反應和抑制免疫反應中扮演著重要作用，本課題中exosome的來源為小鼠肺臟組織，我們探討肺臟組織來源的exosome是否參與了肺臟免疫耐受的維持，通過建立哮喘動物模型來驗證我們的這一猜想，從而為呼吸道免疫耐受失衡相關疾病提供新的思路。
　　首先我們對肺臟來源的exosome(exosome from lung，L-EXO)進行鑒定，電鏡結果表明我們提取的

4、L-EXO直徑一般在30-100nm之間，通過密度梯度離心密度范圍為1.09g/ml到1.17g/ml之間，且表達CD63、TSG101和HSP70等exosome標志性蛋白，而不表達質(zhì)膜相關蛋白GRP94。此外，L-EXO還表達免疫抑制分子TGF-β1和IL-10。我們發(fā)現(xiàn)L-EXO能在體外明顯抑制CD4+T細胞的增殖，并誘導Treg的產(chǎn)生，采用TGF-β1受體阻斷我們發(fā)現(xiàn)L-EXO對CD4+T細胞增殖抑制的能力幾乎消失了，說明L-E

5、XO具有免疫抑制功能依賴于TGF-β1。接著，我們探討了L-EXO的具體來源細胞。L-EXO表面表達CD8、CD11c和SPB(surfactantprotein B)，采用磁珠分選的方法分選出CD11c陽性和CD8陽性的L-EXO，我們發(fā)現(xiàn)分選的CD11c陽性的L-EXO同時表達CD8;反之亦然。而且只有該群L-EXO具有抑制CD4+T細胞的增殖的能力，說明具有免疫抑制功能的L-EXO是來源于CD8陽性的樹突狀細胞(dendritic

6、 cells，DCs)。
　　體內(nèi)實驗部分我們采用OVA誘導的小鼠急性哮喘模型，探討我們分離出來的L-EXO是否參與肺臟免疫耐受的維持，通過尾靜脈回輸L-EXO后分析肺泡灌洗液的細胞成分、各種細胞因子和肺臟病理變化，我們發(fā)現(xiàn)L-EXO對哮喘癥狀有一定的緩解效應，根據(jù)之前的分選L-EXO亞群的結果我們分選出CD11c+L-EXO回輸小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)對哮喘的緩解效果更好，所以體內(nèi)體外結果均提示我們L-EXO對哮喘的癥狀有一定程度的緩解。接

7、下來我們想知道L-EXO對哮喘的緩解作用是否依賴于TGF-β1。體內(nèi)實驗結果表明回輸正常小鼠L-EXO后，Smad3+/-小鼠哮喘緩解效果較對照野生型C57小鼠差，但L-EXO對Smad3+/-小鼠的哮喘仍具有一定的緩解作用。鑒于，我們在L-EXO中同時還發(fā)現(xiàn)較高水平的IL-10。因此，我們進一步評價L-EXO攜帶的IL-10是否參與其對小鼠哮喘的緩解作用。我們分選了IL-10-/-小鼠的L-EXO回輸給C57小鼠，雖然具有緩解哮喘的效

8、果，但與正常小鼠來源的L-EXO相比，其作用要明顯削弱，這些實驗數(shù)據(jù)提示L-EXO依賴于TGF-β1和IL-10維持呼吸道的免疫耐受。
　　為進一步明確L-EXO在維持呼吸道免疫耐受中的作用，我們采用中性鞘磷脂酶小干擾RNA敲低3LL肺癌細胞中Smpd3的表達，并證實了當Smpd3的表達被被抑制之后，可明顯抑制exosome的分泌。之后，體內(nèi)也驗證了當給予小鼠鼻飼滴入Smpd3干擾慢病毒后小鼠肺臟分泌exosome的量減少，同時我

9、們可以觀察到，OVA誘導的小鼠急性哮喘癥狀明顯加強，而外源性回輸L-EXO后小鼠的哮喘癥狀可以得到緩解，表明L-EXO參與了呼吸道免疫耐受的維持。
　　綜上，在本課題的研究中，我們發(fā)現(xiàn)L-EXO具有免疫抑制功能，能夠通過其攜帶的TGF-β11和IL-10緩解OVA誘導的小鼠急性哮喘，而生理存在的L-EXO對老鼠哮喘的癥狀具有重要的影響。我們的研究結果為解釋肺臟免疫耐受提供了一種新的機制，同時也提示我們可以通過增加L-EXO的分泌治